肠道微生物组学和代谢组学用于酒精性肝病精准诊断及治疗的价值

韩白乙拉 常冰 王炳元

部分持续过量饮酒(折合纯酒精，女性>40 g/d、男性>60 g/d)短期内可发生酒精性肝炎(AH)。AH的自然病程研究仍较有限，发病机制尚不十分清楚[1]。近年来研究表明，酒精及其代谢产物乙醛不仅可导致肝细胞损伤，更重要的是引起肠道微生物多样性改变，损伤肠道黏膜的完整性和先天免疫功能，其结果导致肠黏膜屏障破坏，增加肠道通透性(肠漏)。失调的肠道微生物群及其代谢产物通过被破坏的细胞间连接直接进入门脉系统，可能是发生酒精性肝病(ALD)的基础和重要原因[2]。移位的微生物种类和数量决定于饮酒者肠道“核心微生物群”的种类和数量[3]。由于方法学的限制，迄今尚无理想的定量核心微生物群方法。

一、饮酒与肠道微生物群

肠道微生物群是人体最庞大而复杂的微生物群落,也是人体的重要代谢“器官”。有益的肠道微生物和噬菌体与宿主形成共生关系，通过各种机制促进宿主防御，参与肠道的消化、分泌、吸收和新陈代谢，以及调节宿主的免疫功能等。肠道细菌的数量和质量变化、肠道通透性改变以及细菌产物(如内毒素)与实验性和人类疾病中ALD的发生甚至肝硬化的进展密切相关[3]。肠道微生物群的定量可以作为ALD早期生物标志物和潜在的临床治疗药物[4]。

任何形式的饮酒均可导致肠道微生态失衡，似乎中度饮酒更易造成酒精性肝硬化(AC)。 患者小肠细菌过度生长(SIBO)，后者与 AC 的严重程度密切相关。AC 患者长期应用质子泵抑制剂似乎会增加肠道链球菌科、粪便的毛螺旋菌和厚壁菌门下的瘤胃球菌科的数量，加剧内毒素血症和细菌移位[1]。无菌小鼠(C57BL/6)比普通小鼠对酒精性肝损伤的易感性更高。说明完全缺乏肠道微生物群和微生物群失衡都容易导致ALD的发生。研究人员试图将酒精抵抗的鼠粪菌作为供体，移植到对酒精敏感的鼠或用益生元来治疗酒精诱发的肝损伤[5]。

酒精还可导致胃肠蠕动减少、胃内pH值增加，进一步促进SIBO，后者可导致长链饱和脂肪酸合成减少，小肠内拟杆菌门和厚壁菌门的数量明显降低，革兰阴性菌(如变形菌门)和革兰阳性菌(如放线菌门)数量明显增加，导致内毒素血症[6]。通过细菌的16s rRNA区域序列分析发现， AC患者粪便中的普雷沃氏菌科数量比乙型肝炎肝硬化患者或健康人群明显增加，即肠道优势菌被抑制，少数致病菌菌种过度繁殖，肠道生理功能受损[3]。

二、肠道微生物的测定

肠道微生物在健康或疾病个体中的作用常常是从粪便中推测出来的。粪便检测包括微生物多样性、密度和丰度，容易取样。粪便微生物分析是确定肠道微生物群与宿主健康和疾病之间关系的常用方法，其依据是粪便代表了整个肠道的大部分微生物种群[4]。但是，胃肠道是一个多器官系统，微生物具有很大的区域多样性，每一个器官所在的位置都专注于特定基因功能表达，调节复杂且多样化的消化、免疫、代谢和内分泌过程[4]。研究者一直在寻找如何取材方便、并能反映胃肠道整体微生物瞬时变化的方法，以便于发现瞬时变化与疾病的因果关系。

大多数微生物生态学分析旨在确定与应激源或疾病相关的特定微生物组，常使用高通量标记基因或鸟枪法(shotgun)宏基因组学数据来测量微生物群落特性，如丰富度(指一个群落或生境中物种数目的多寡)、均匀度(指一个群落或生境中全部物种个体数目的分配状况，它反映的是各物种个体数目分配的均匀程度)和β-多样性(指沿环境梯度不同生境群落之间物种组成的相异性或物种沿环境梯度的更替速率，也被称为生境间的多样性)。

Smirnova等[1]根据美国国家酒精滥用和酒精中毒研究所(NIAAA)AH的共识定义和严格的排除标准，最后纳入78例受试者进行研究。其中健康对照(HC)组24例，酗酒对照(HDC)组20例，中度酒精性肝炎(MAH)组10例，重度酒精性肝炎(SAH)组24例。对受试者的粪便样本进行16s rRNA基因测序、多标签测序(MTS)、主坐标分析(PCoA)、PICRUSt(phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)分析、随机森林分类和回归模型等，分别建立AH和终末期肝病(MELD)评分的预测模型，推断功能性基因组学；采用液相色谱-质谱联用仪测定粪便样品中的短链脂肪酸(SCFAs)浓度，评估应激源(慢性高剂量酒精)和疾病(AH)引起的肠道微生物组学和代谢组学变化[1]。

三、研究结果和意义

(一)酒精影响肠道细菌的种类 与HC组相比，HDC组富含厚壁菌并伴有明显的拟杆菌减少；从HDC组、MAH组到SAH组，厚壁菌丰度呈阶梯式下降。从HC组、HDC组、MAH组，变形杆菌的比例略有增加。然而，与HC组和HDC组相比，SAH患者的变形杆菌比例显著增加。

(二)酒精影响细菌的多样性 细菌的多样性在对照组之间没有显著差异，但随着AH的加重，多样性有减少趋势，意味着多种正常功能丧失，肝脏保护作用与损伤因素间的平衡打破，从而增加对酒精损伤的易感性。

(三)酒精影响肠道SCFA的产生 靶向代谢组学技术分析SCFA结果表明，AH患者的SCFA降低，产生SCFA的微生物菌水平降低。

(四)肠道菌群的差异提示AH可能有更多的微生物亚群 几例HDC患者的微生物组成与AH患者相似，也有几例MAH或SAH患者微生物组成与HDC相似，意味着根据粪便微生物组的不同，在临床定义为AH的人群中可能存在亚群。

(五)其他 不同药物治疗可导致患者粪便微生物组出现差异；尽管微生物组组成随AH的发展而变化，但它并不是疾病严重程度的预测指标；酒精影响肠道细菌基因组的功能，影响多条能量代谢途径，包括多种氨基酸、含氨基糖、核苷酸糖、淀粉和蔗糖、鞘脂代谢等。该项研究提供了因酗酒而引起的粪便微生物组变化以及与AH相关变化的新信息，也提供了关于粪便微生物组和代谢组学的结果与疾病发展之间的新见解，为AH疾病的治疗提供新的思路[7]。

四、研究的局限性

(1)在临床诊断AH时，一些患者可能已合并肝硬化，而另一些患者可能仅为AH[8]，还有一些患者有失代偿性肝硬化，以及与失代偿期肝硬化相关的并发症，包括感染、腹腔积液和肝性脑病等，同样会诱发肠道微生物失调，在这项研究中未被提及；(2)该研究中登记的饮酒患者在收集粪便样本时的疾病严重程度和环境各不相同。大多数HDC受试者在门诊采集粪便样本，而AH患者在入院后72 h内采集粪便样本。代谢应激本身会导致肠道微生物群发生变化，这种变化发生在代谢损伤后的早期，并且可能会持续到住院期间[4]。另外，同一个人的肠腔菌群和黏膜菌群组成明显不同，人与人、地区与地区以及性别之间的肠腔菌群也不同。粪便样本不一定能全面反映肠道所有部位菌群(肠腔菌群和肠黏膜定植菌群)。在ALD患者中，粪便菌群还受小肠SIBO影响；(3)多种混杂因素导致微生物群落变异。成年人的胃肠道处于一种不断重塑的状态，这是基于年龄、性别、遗传组成(肠道微生物群是可遗传的)、环境、饮食、生活习惯、客观和主观的相互作用、急性和慢性疾病状况以及受试者体内的空间差异等[3]。环境因素、饮食习惯、药物或毒物是影响肠道菌群构成的最重要因素，遗传、肠道运动障碍、代谢压力、胃酸降低(SAH患者比其他患者接受更多的抑酸剂)、胆汁减少和免疫异常等，直接或间接影响肠道微生物组成[6]。特别是住院患者的饮食结构单一，通常缺乏可发酵的可溶性膳食纤维，或者患者可能由于各种原因限制饮食，也是导致肠道微生物组(如产生SCFA的细菌)的异质性和功能基因组学不稳定、SCFA水平变化的常见原因[7]；(4)SAH患者比其他患者接受更多的抗生素，当粪便微生物组成发生变化时，其他代谢物或代谢途径也可能随之改变。目前的研究并未涵盖细菌以外的微生物，如真菌和病毒等，后者可以直接影响宿主与细菌之间的相互作用，真菌可以影响ALD患者的疾病进展、发病机制和临床结局[9]。但对肠道细菌基因组学和代谢组学的影响所知甚少； (5)元基因组学能够推断微生物类群变化的功能后果，而不能直接确定不同微生物群的功能。然而，由于粪便中的RNA酶的差异，评估粪便中微生物转录组的能力更具挑战性。应用可靠方法来测定粪便中微生物基因的表达以及与粪便和尿液中代谢物谱的联系，用于了解它们在疾病的发生过程中的角色。

尽管存在这些局限性，该研究的发现为AH的肠道微生物群特征提供了新的见解，为ALD发病机制的研究和有针对性的干预措施奠定了微生物理论基础。

五、未来研究方向

粪便微生物群的组成和代谢被视为肠道微生态系统动态变化过程的缩影。随着时间的推移和宿主生活方式的改变而持续变化。未来研究应着眼于纵向的方法学设计，以解释可能或目前正在影响肠道微生物群和ALD程度的混杂因素，利用这些信息制定新的预防和治疗策略[7]。

总之，本文提供了酒精引起的粪便微生物群变化与日益严重的AH相关的额外变化的新信息。提供了关于粪便微生物组与疾病进展关系的见解，从而更全面地理解粪便微生物组在AH中的作用和探讨未来AH的治疗新靶点。