基于5-hmC的液体活检在早期肝细胞癌诊断中的应用价值

郑立威 李德瑶 鲁凤民 陈香梅

原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，居癌症相关死亡原因的第二位，近年来发病率持续增长，严重威胁我国人民的生命健康[1]。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌的主要病理类型，占原发性肝癌的85%～90%[1]。HCC的早期发现、诊断及治疗是改善患者生存预后的关键。我国85%以上的HCC与慢性HBV感染有关，因此在慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)患者中进行HCC筛查和监测是实现HCC早诊断的最有效途径[1-2]。

目前临床上用于HCC检测和诊断的血液学指标主要有血清甲胎蛋白(AFP)、甲胎蛋白异质体(AFP-L3)、异常凝血酶原(DCP)等，其中AFP为肝癌诊断和疗效监测中最常用且重要的标志物[1-3]。研究表明，AFP在HBV感染相关HCC的诊断、预后评估方面都有一定价值[3-4]。但由于HCC隐匿性高，血清AFP诊断早期HCC的能力十分有限，经此确诊的大部分患者已处于疾病进展期，并且在非HBV相关HCC患者中，AFP诊断HCC的灵敏度和特异度较低[4]。因此，当前亟需开发能够诊断早期HCC的无创性标志物，以对HCC进行更早的干预和治疗。

一、关于5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5-mC)

近年来，血浆中细胞游离DNA(cfDNA)在肿瘤诊断中的应用受到越来越多的关注。cfDNA中含有由肿瘤细胞凋亡或坏死而释放至外周血的DNA，因此cfDNA不仅含有与原发肿瘤细胞相同的体细胞突变类型，而且还具有相同的表观遗传模式[5]。其中，cfDNA的甲基化是目前研究最广泛的一类表观遗传学特征，尤其是CpG岛上的5-mC修饰。已有多项研究表明，cfDNA的甲基化检测可作为包括HCC在内的多种肿瘤的诊断及预后指标[6]。DNA去甲基化也是真核细胞表达调控的一种重要模式。在DNA去甲基化过程的第一步，5-mC在TET蛋白的作用下被氧化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)[7]。5-hmC不仅是DNA主动去甲基化过程的中间产物，也是一种稳定存在的表观遗传标记[8]。相较于5-mC修饰的沉默效应，5-hmC修饰可以引起基因的激活表达，因此这一类表观遗传学修饰模式具有更高的疾病特异性，且能动态、灵敏地反映疾病状态下基因的表达水平。而近年来的研究发现，5-hmC在多种肿瘤中缺失，提示cfDNA的5-hmC检测在肿瘤筛查、诊断及预后预测中具有潜在应用价值，也为HCC的诊断带来了新的可能[9]。

二、5-hmC的检测方法

目前已建立的5-hmC检测方法包括UHPLC-MS/MS、hMe-Seal、5-hmC-Seal等[10-12]。其中5-hmC-Seal是在hMe-Seal技术基础上优化而成的全基因组5-hmC检测方法，可以在1～10 ng cfDNA中对5-hmC进行基因图谱的绘制，是目前最先进的5-hmC检测技术[12]。

5-hmC-Seal技术利用β-葡糖基转移酶选择性地将一个化学修饰过的葡糖基(6-N3-glucose)转移到5-hmC的羟基上，然后向叠氮基团标记的5-hmC中加入生物素，通过磁珠对5-hmC修饰的DNA片段进行富集，结合高通量测序技术分析5-hmC在基因组上的分布情况[12]。应用5-hmC-Seal方法，已在结直肠癌、胃癌、食道癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤患者血浆cfDNA中检测、分析5-hmC修饰水平，结果显示血浆cfDNA的 5-hmC检测可用于辅助癌症诊断[13]。

三、5-hmC在HCC诊断中的应用

近期，Cai等[11]通过一项包括1 204例HCC患者、392例CHB或LC患者及958例健康对照的队列研究，建立了一个基于受试者血浆cfDNA 5-hmC修饰的HCC诊断模型。该研究将受试者分为训练集与验证集，通过对训练集结果的分析筛选出了917个在HCC与CHB/LC患者中 5-hmC水平存在差异的候选基因。进而通过弹性网络正则化方法及逻辑回归模型从中筛选出了由32个在HCC患者cfDNA中5-hmC水平显著升高的基因组成的5-hmC标志物组合(5-hmC marker panel)，并最终建立了一个用于HCC诊断的加权评分(wd-score)诊断模型[11]。

尽管wd-score模型对晚期HCC的诊断效能与AFP相当，但在区分早期HCC患者与健康对照、早期HCC患者与CHB/LC患者方面，该模型的诊断效能显著优于AFP。值得注意的是，联合AFP与wd-score模型能够进一步提高诊断效能(AUC提高约1%)[11]。此外，早期HCC患者wd-score评分随HCC分期进展而升高。除分期外，wd-score还能预测肿瘤大小[11]，提示该模型或可作为HCC治疗过程中疗效的监测指标。将wd-score评分用于原发性胰腺导管腺癌(PDAC)患者发现，该模型可较好区分HCC及PDAC[11]，表明对HCC诊断具有特异性。

四、5-hmC与HCC相关性的潜在机制

多项研究表明，5-hmC修饰在外显子、增强子区域富集[11, 13-15]，表明该修饰与基因表达激活相关。而肿瘤患者中5-hmC水平的异常[11, 13, 15]，则提示了5-hmC修饰在肿瘤发生、发展中的潜在作用。因此，探索5-hmC在肿瘤发病机制中的作用不仅有助于阐明5-hmc作为肿瘤标志物的潜在机制，亦有利于肿瘤治疗新靶点的开发。Cai等[11]对917个在HCC与CHB/LC中 5-hmC水平存在差异的候选基因进行KEGG富集分析发现，这些5-hmC水平异常的基因主要富集在各种代谢过程通路中，如“甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢”等，且其中相当一部分基因与HBV感染、肝纤维化和HCC的发病机制有关[11]， 提示5-hmC可能参与了HBV感染相关的肝脏疾病的发生和发展。通过TCGA数据库分析发现，HCC患者cfDNA中5-hmC修饰水平最高的几种基因在HCC中表达上调[11]，提示5-hmC修饰与基因表达调控相关，且这种表达调控功能可能通过H3K4me1和H3K27ac组蛋白修饰介导[11, 14]。

五、5-hmC作为HCC诊断的血清学标志目前仍需解决的问题

作为一种新型肿瘤标志物，已有多项研究报道了5-hmC在肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌等肿瘤组织及cfDNA中的异常表达状态[11, 13-15]。与HCC、胶质母细胞瘤等肿瘤不同，肺癌患者cfDNA的5-hmC水平低于健康对照，且随肺癌分期进展逐渐下降[13]，提示5-hmC水平的变化在不同肿瘤中意义不同。在结直肠癌及胃癌中，可以分别通过检测不同的特异性5-hmC修饰差异位点来区分患者与健康对照[15]，这说明5-hmC的诊断panel具有疾病特异性。尽管不同肿瘤背景下5-hmC富集的基因座的差异决定了Cai等[11]开发的wd-score诊断模型对HCC具有特异性，但此模型仅在HCC和小样本的PDAC患者中进行了临床诊断效果验证，其HCC特异性尚需在胃癌、肺癌等其他常见肿瘤中进行进一步的验证。

LC患者是发生HCC的高危人群，其HCC年发生率约为1%～8%，且随着年龄的增加，HCC的发病率也不断增长。从成本效益分析来看，在肝硬化人群中进行早期HCC的筛查监测效果更佳[1-2]。Cai等在研究中未区分LC及CHB受试者，wd-score在单独鉴别诊断LC与HCC患者时的诊断效能仍需在更大样本量的临床研究中得到证实。由于HCC患者基础病史不同，在慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性及非酒精性脂肪肝等不同慢性肝病发展形成的HCC患者中，5-hmC修饰水平是否存在差异也需进一步结合临床数据进行分析探究。

此外，值得注意的是，由于cfDNA组成成分复杂，仅有一部分cfDNA来源于肿瘤细胞，因此cfDNA中检测到的突变(如KRAS、TP53突变)可能来自于cfDNA中的非肿瘤细胞部分，如造血细胞等[16]。而cfDNA表观遗传学改变与肿瘤细胞基因组改变的关系目前还尚不清楚，但研究结果显示cfDNA的5-hmC修饰水平的变化可能与肿瘤细胞并不一致[9-11, 15]，因此cfDNA诊断假阳性的问题仍值得关注。结合cfDNA上的肿瘤特异性突变(如EGFR、BRAF等)[16]或特定区域表观遗传修饰改变，将有助于这一问题的解决。

综上所述，尽管大规模推广5-hmC作为HCC的液体活检仍存在诸多问题，5-hmC检测因其操作无创性、组织特异性好、肿瘤特异性高，并且在HCC早期诊断时灵敏度和特异度均优于血清AFP这一系列优点，有望在不久的将来应用于临床肝癌诊断。但若想将cfDNA中的5-hmC修饰作为新型肿瘤标志物进行推广，目前的5-hmC检测方法即5-hmC-Seal仍需要进一步简化和标准化，以增加检测的准确性和可重复性，并降低成本。