HPV感染对宫颈癌细胞中自噬的影响

王芳，霍彦，王宇全，徐燕颖，孙蓓

自噬是一种生理途径，介导大分子和受损结构的降解，在维持体内平衡、调节关键细胞功能和应激反应中起关键作用。因此，为了破坏细胞活性并为病毒复制创造更有利的环境，许多病毒进化出操纵宿主自噬反应的巧妙策略。自噬在介导致癌病毒的感染、持续存在并诱导肿瘤发生中起着特别重要的作用。近年来，自噬与致癌病毒感染间的关系已得到广泛关注。高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）作为一种致癌病毒在其生命周期中具有改变细胞自噬的能力，并且有证据表明从病毒感染到肿瘤发生的每个步骤中病毒蛋白通过许多不同机制起到抑制宿主自噬反应的作用[1]。现综述HPV感染与宫颈上皮细胞自噬间的关系，进一步阐明致癌病毒HPV诱发宫颈上皮病变的机制，并为控制HPV感染及构建治疗性疫苗提供新的思路和方法。

1 自噬与肿瘤发生的关系

1.1 自噬的定义及分子特征1963年Chirstian de Duve最先描述了自噬是一种溶酶体介导的降解细胞内非必要或有害成分的过程。根据递送降解物途径不同，自噬可以分为伴侣介导自噬、微自噬和巨自噬。在分子伴侣介导自噬中，分子伴侣通过与溶酶体相关膜蛋白2A（LAMP-2A）相互作用，将胞质中含有特定序列的未折叠蛋白转移到溶酶体中[2]。微自噬的特征是溶酶体膜直接吞噬了细胞质物质[3]。在巨自噬中，双膜细胞器（自噬体）隔离细胞质物质，然后与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，其中物质被溶酶体水解酶消化[4]。自噬是一种复杂的机制，自噬途径中包括了多种成分，微管相关蛋白轻链3（LC3）在自噬过程中定位于自噬体及自噬溶酶体；其裂解产物LC3-Ⅱ的量与自噬溶酶体形成的程度相关，是观察自噬活动的第一个分子标志。Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K） 是 Beclin 1的同源物，他们通过共同的螺旋结构域键直接结合后即可诱导自噬发生，Beclin 1由于其在自噬囊泡形成中具有必不可少的功能而处于中心位置，可以诱导自噬的发生。p62作为重要的选择性自噬接头蛋白与泛素化蛋白和LC3/Atg8连接，进入自噬溶酶体完成泛素化底物降解过程。由于在溶酶体降解过程中p62被蛋白水解酶降解。因此，p62水平升高通常被认为是自噬活性受到抑制的标志。p62积聚也使基因组不稳定从而促进肿瘤的发展[5]。

1.2 自噬在肿瘤发生中的作用自噬在恶性肿瘤的发生和发展过程中的不同阶段发挥了促肿瘤和抗肿瘤作用。自噬功能通过清除细胞毒蛋白和受损细胞器，调节细胞死亡和衰老，维持细胞内稳态和基因组稳定性，早期阶段可以抑制肿瘤的发生。在恶性肿瘤发展的后期，由于氧化应激和营养缺乏可以诱发自噬，自噬通过启动细胞生存反应和分解多余的细胞器和蛋白质以获取能量，从而有利于肿瘤的发生。

自噬通过去除受损的线粒体、活性氧簇（ROS）和长寿命蛋白来避免细胞恶性转化。在实体瘤中均发现有自噬相关蛋白Beclin 1功能丧失突变[6]。Beclin 1基因缺失小鼠表现出较高的自发性恶性肿瘤，表明自噬在体内确实发挥肿瘤抑制作用。此外，在恶性肿瘤进展中，葡萄糖/氧的消耗导致ROS产生增加，肿瘤微环境中的细胞外酸中毒可能激活自噬为肿瘤发展提供能量[4]。研究发现通过促进细胞凋亡抑制自噬可以适当增强淋巴瘤小鼠模型的化疗效果，这证实了自噬过程增加了机体对恶性肿瘤治疗的抵抗，自噬抑制了癌细胞的凋亡从而促进恶性肿瘤的发展。因此，自噬激活可能对于预防恶性肿瘤发生是重要的，但在能量和营养缺乏条件下自噬对于癌细胞生存而言也是必需的。准确理解复杂的自噬与恶性肿瘤之间的关系，掌握抑制或激活自噬的准确时机，对于了解恶性肿瘤包括宫颈癌发生的机制以及找到新的治疗靶点是必不可少的。

2 HPV感染对宫颈细胞自噬的影响

HPV是由双链DNA基因组（8 kb）和非包膜二十面体衣壳蛋白组成，已知感染人类生殖器和肛门的几种HPV基因型是致癌的，然而大多数HPV感染是自限性的，并且在24个月内清除，相反地致癌型HPV持续感染是宫颈癌的主要原因。HR-HPV如HPV-16和HPV-18感染占宫颈癌病例的比例约为70%[7]。单纯病毒感染不足以致癌，自噬水平减低是重要的致癌因素，近年来自噬作为靶向人类恶性肿瘤（包括宫颈癌）的生物学机制研究备受关注。自噬在大多数病毒家族的生命周期中扮演抗病毒和促病毒的角色，但是在宫颈癌中，HPV与自噬之间的关系可能是独特和复杂的。

HPV是一种可以感染宿主角质形成细胞并诱发自噬反应的病毒。电子显微镜分析发现HPV假病毒（PsVs）进入细胞可以诱发自噬体形成，当用自噬抑制剂治疗时，HeLa细胞被 HPV-16假病毒体（16PsV）感染水平增加，表明自噬参与了HPV感染。当HeLa细胞接种16PsV时，透射电子显微镜显示存在杯形、双膜囊泡（phagophores）和双膜结合囊泡，这是自噬体的典型结构。这些结果证实HPV-16感染过程确实诱导了自噬，而且自噬是宿主细胞防御功能的表现。此外，LC3斑点与16PsV共定位，推测自噬体在该过程中与16PsV颗粒非常接近[8]。已有研究支持HPV-16感染诱导自噬反应的观点，包括在宿主角质形成细胞中自噬标记蛋白的上调[9]。

由HPV-16病毒粒子诱导的宿主自噬是原代角质形成细胞的宿主防御机制，通过迅速降解进入细胞的病毒粒子来抑制HPV-16感染，但是宫颈癌中升高的自噬水平不容易被观察到，因为升高的自噬趋势很快被HPV所抑制，导致自噬水平甚至低于正常值。这种现象常被错误理解为HPV不会激活自身自噬[10]。

自噬损伤在宫颈癌细胞中更明显，与邻近正常组织相比，宫颈组织从低度鳞状上皮内病变（LSIL）向高度鳞状上皮内病变（HSIL）的异常转化中p62表达逐渐增加，表明病变进展期间的自噬损伤可能与HPV介导的致癌过程相关[11]。与p62相反，Beclin 1表达在恶性肿瘤进展期间降低，因为在异常转化的宫颈细胞中发现其水平显著降低，在宫颈癌样本中甚至更少，证实在HPV介导的宫颈细胞转化期间自噬反应被进行性抑制。通过免疫组织化学测定，Beclin 1水平与宫颈癌分化、淋巴结转移、复发、死亡和组织学分级呈负相关，表明自噬在恶性肿瘤发展中的基本作用[1]。除Beclin 1外，LC3量也与HR-HPV感染和更多的临床肿瘤病灶和淋巴结转移呈负相关[12]，再次表明HPV感染的宫颈组织中自噬减少，受感染患者的临床病理特征更差，说明HPV感染诱发宫颈病变的过程中宫颈细胞自噬反应受到了损伤。

3 宫颈病变进展中HPV抑制自噬反应的机制

宫颈病变的进展受多因素、多步骤的控制，仅有HPV感染并不足以致癌，需要额外的内源性或外源性信号与HPV一起诱导宫颈癌的发生。HR-HPV靶向多种细胞调节和信号通路的激活才能促使细胞恶性转化。HPV影响自噬的机制有如下可能。

3.1 HPV激活多种信号通路途径抑制细胞自噬与许多病原体一样，HPV通过与细胞表面肝素磺化蛋白聚糖（HSPGs）结合而进入靶细胞，并诱导多种信号通路迅速激活。这些信号可能被用来欺骗宿主的防御系统，从而使病毒安全进入细胞。为了延长感染周期，HPV试图抑制细胞凋亡，并发展出几种激活蛋白激酶B（AKT）的方法，HPV通过增强胞内PI3K上游调节器的功能或抑制负调节性磷酸酶，激活宿主细胞PI3K/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路抑制自噬，AKT的下游效应器mTOR是一种重要的代谢传感器，整合了多种细胞信号，在调节许多病理生理过程中起着关键作用。研究发现，HPV-16感染后激活mTOR并触发mTORC1底物，然后快速抑制自噬[13]。这个过程既有利于病毒复制，又抑制了宿主细胞的自噬清除HPV，从而延长感染周期。除了PI3K/AKT/mTOR信号通路外，Surviladze等[14]发现HPV-16与表皮生长因子受体（EGFR）和角质细胞生长因子受体（KGFR）相互作用后对丝裂原活化蛋白激酶（细胞外调节激酶1/2）[MAPK（ERK1/2）]通路具有促进作用。激活 MAPK（ERK1/2）途径也可激活mTOR达到抑制自噬的目的。MAPK（ERK1/2）和PI3K/AKT效应器路径之间的串扰产生对生长因子（GF）刺激相互依赖性响应，HPV与细胞表面生长因子受体（GFRs）的相互作用很可能触发这些通路之间的类似通讯，从而激活互补信号，抑制自噬、逃避细胞凋亡、增强病毒转录和翻译、促进增殖，延长感染时间[15]。

3.2 HPV早期蛋白对自噬过程的影响HPV损伤自噬还与HPV早期蛋白相关，它们对自噬的影响在致癌过程中的重要作用目前已被重视。HPV早期蛋白E5、E6和E7癌蛋白进化出多种机制影响宿主自噬途径以诱导细胞转化，这说明了自噬在病毒介导的肿瘤发生每个步骤中都很重要。在HPV-16阴性角质形成细胞系中外源性表达HPV-16 E5可以降低自噬体标志物LC3-Ⅱ水平，防止自噬底物p62的降解，并且减少角质细胞生长因子（KGF）和血清饥饿诱发细胞中自噬体的数目，提示自噬体组装失败。相反地，从HPV阳性细胞中敲除E5可消除这些效应，证实在自噬的非常早期阶段E5表达导致自噬抑制[1]。研究证实E5干扰自噬基因的转录激活，下调关键自噬基因的mRNA水平，如Beclin 1、ATG5、LC3、ULK1、ULK2、ATG4a和 ATG7，从而抑制吞噬泡装配[16]。HPV16 E6/E7是通过影响自噬体-溶酶体融合来抑制自噬，从而提供了在HPV致肿瘤发生过程中抵抗自噬进展的另一种机制。原代人角质形成细胞中HPV16 E6/E7过表达增加了脂质化的LC3和p62表达，表明尽管自噬体仍在积聚（LC3-Ⅱ增加），但降解能力降低（p62增加）。此外，共聚焦和电子显微镜分析显示E6/E7细胞中自噬溶酶体形成减少，提示了这些病毒癌蛋白影响自噬体和溶酶体之间的融合阶段[17]。

自噬后期步骤中的损伤主要是由于E6/p53依赖性机制，因为单独HPV16 E6表达增加了LC3-Ⅱ和p62，并且与E6野生型相比，p53降解缺陷的E6突变体与E7结合增加p62表达能力降低[18]。研究证实在HPV16 E6癌蛋白表达的角质形成细胞中，使用蛋白酶抑制剂MG132和凋亡抗原1（APO-1）共同治疗后可以恢复p53活性并诱导自噬和p53依赖性细胞凋亡的发生[19]。因此证明细胞核中p53是促细胞凋亡和（或）促自噬的转录因子。蛋白酶抑制剂MG132和APO-1共同治疗促使p53再活化，与自噬相关的p53靶基因LC3B的表达增加，从而提高了自噬水平。使用针对E7序列的小干扰RNA（siRNA）消耗双顺反子HPV16 E6/E7 mRNA可以诱导自噬基因的显著富集和自噬激活，例如自噬体的出现、LC3的点状表达、LC3-Ⅰ转化至LC3-Ⅱ，并且自噬底物p62的水平降低。

ATP酶家族AAA结构域含有3A蛋白（ATAD3A），已被证明是宫颈癌中的一种抗自噬因子。Chen等[20]的研究表明，宫颈癌细胞中ATAD3A表达与HR-HPV感染、国际妇产科联盟（FIGO）分期、淋巴结受累、细胞间质表皮转化因子（c-MET）表达、白细胞介素8和患者存活率存在显著相关性。此外，沉默E6/E7表达将降低ATAD3A表达和细胞存活，且敲低ATAD3A的表达可增加细胞自噬和细胞凋亡，降低耐药性[21]。说明HPV感染与宫颈癌中ATAD3A表达增加和耐药性相关，持续性HR-HPV感染可稳定ATAD3A表达以抑制细胞自噬和凋亡以及增加耐药性。

3.3 HPV利用宿主基因抑制宫颈细胞自噬作用为了自身复制利用宿主基因和蛋白质，HR-HPV对宿主miRNA表达产生影响，HR-HPV感染的宫颈组织微小RNA（miRNA）测序显示miR-224-3p在宫颈病变和癌组织中表达增加。在宫颈癌细胞系中过表达或抑制表达方法证明miR-224-3p通过改变参与自噬体形成的蛋白质FIP200水平来调节自噬[22]。因此，HPV通过过表达miR-224-3p降低FIP200的表达来操纵宿主自噬[23]。另有研究发现miR-155-5p表达在宫颈癌组织中显著下调。HPV阳性细胞系中抑制miR-155-5p的表达水平可以抑制LC3，同时通过丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）/mTOR依赖性机制可以促进p62蛋白表达，说明该细胞系存在自噬缺陷[24]。

总之，上述研究强调了HR-HPV通过许多不同的机制广泛影响自噬，其具有抑制细胞自噬反应的共同终点。因此，操纵宿主自噬是HPV介导恶性转化的关键调节因子，并且可以成为开发创新药物的合理靶向，也可用于监测HPV相关疾病的临床结局的有用生物标志物。

4 自噬对HPV疫苗作用的影响

众所周知HPV疫苗对宫颈癌有预防作用，先天免疫细胞对启动保护性疫苗反应和抵抗感染非常重要。作为细胞免疫系统的重要调节成分，自噬不仅介导病原体的清除和细胞因子的产生，而且还通过防止有害的过度反应来平衡免疫反应。自噬是先天免疫和适应性免疫之间的桥梁[25]，其通过向B细胞和T细胞传递病原体复合物参与抗原提呈，这对有效的免疫保护至关重要。在感染时，自噬也可以被一些病原体劫持复制或逃避宿主的免疫反应。因此，自噬对免疫反应来说具有双面作用，更好地理解这一双重潜能将有助于利用先天免疫细胞的自噬，优化针对预防HPV感染或治疗的疫苗构建[26]。

近年已证实自噬在先天免疫和适应性免疫中的重要作用。自噬通过传递主要组织相容性复合物Ⅰ类（MHC-Ⅰ）和Ⅱ类（MHC-Ⅱ）抗原，将病毒或细胞内细菌等细胞内病原体包裹并靶向清除功能，在细胞免疫中发挥重要作用。自噬还通过去除病原体和诱导获得性免疫参与先天免疫应答。树突细胞（DCs）是连接先天免疫系统和适应性免疫系统的最有效的专业抗原提呈细胞之一，它们在初始T细胞激活和驱动保护性免疫抵抗感染方面特别关键。越来越多的研究发现自噬在生理和病理情况下参与DCs的各种功能[27]，特别是在T细胞活化方面，促进宿主对HPV病毒清除[28]。

虽然目前有宫颈癌的预防性疫苗，但仍没有治疗性疫苗可以投入临床。因此，生产一种有效的治疗HPV疫苗成为研究热点。Pérez-Trujillo等[29]构建一种全长HPV-16 E7的DNA疫苗，其两侧有靶向内质网序列，将抗原靶向到内质网可以增强抗肿瘤的免疫原性，促进γ干扰素（IFN-γ）的产生和抗肿瘤反应的增加，在宫颈癌小鼠模型中诱导抗肿瘤作用增强。进一步研究其作用机制发现HPV抗原靶向内质网后诱导内质网的应激反应，内质网内过度表达的HPV抗原最初是通过内质网相关降解途径降解，并且可以诱导自噬降解途径激活来补偿蛋白酶体的抑制。因此，自噬同时参与了对E6和E7突变抗原到达内质网后的处理，这将有助于开发更有效的抗癌疫苗[30]。

为了对抗HPV，临床使用的针对E7癌蛋白的DNA疫苗有一些缺点。该方法免疫原性低，对抗原提呈细胞的特异性受限[31]。使用有效的佐剂可以提高表达癌蛋白的DNA疫苗的有效性。使用佐剂诱导自噬是增强免疫应答的一种有前景的策略[32]。作为激活自噬的关键因子Beclin 1，在自噬体形成和自噬体/核内体成熟中发挥重要作用。Beclin 1触发自噬可增强抗原提呈细胞功能，增强免疫应答的效力。Naziri等[33]研究证实Beclin 1与编码E7抗原的HPV-16 DNA疫苗联用能显著提高淋巴细胞的增殖和细胞毒性。与单独使用DNA疫苗相比，这种新组合增加了IFN受体的产生，并高度抑制了肿瘤进展。利用自噬在免疫细胞中的作用对研发治疗HPV感染的疫苗提供了新的策略。

5 结语

HR-HPV在感染的初始阶段对自噬产生影响，以避免病毒颗粒早期被自噬消化清除，并且随后有助于在整个致癌过程中促进感染细胞的转化。3种不同的病毒癌蛋白E5、E6和E7采用不同的策略来抑制宿主自噬，进一步揭示HPV如何操纵自噬通路最终促进宫颈细胞恶性转化。尽管许多不同的细胞通路受到来自不同致癌病毒的癌蛋白的影响，但共同结果是抑制最终的自噬步骤，即自噬体-溶酶体融合，作为自噬抑制的主要靶标。因此，鉴于自噬溶酶体形成对肿瘤病毒导致肿瘤发生的重要性，以及将该步骤用于治疗目的的潜在可能，需要更多的研究来更好地阐明HPV与自噬之间的联系，并确定新的基于自噬的生物标志物验证分子靶点和（或）药物开发。为此，研究发现的自噬诱导物能够增加自噬体-溶酶体融合，增加免疫细胞抗原呈递，找到适当的佐剂诱导自噬[32]，有利于针对HPV感染疫苗的研发，最终达到治疗HPV感染及提出宫颈癌相关临床治疗策略。