液体活检在早期HCC诊断中的应用

郑立威 袁荻森 刘佳 鲁凤民

在我国的常见恶性肿瘤中，原发性肝癌居第4位，肿瘤致死病因的第2位，严重危害国人健康[1]。肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌的主要病理类型，在我国，约86%的HCC与乙型肝炎病毒(HBV)感染相关[2]。对于早期肝癌患者，通过肝切除术在内的根治性治疗可显著改善预后。然而，HCC发病隐匿，患者被诊断时多已在晚期，预后差。

肝脏超声检查(US)联合血清甲胎蛋白(AFP)是目前对HCC高危人群进行肝癌筛查的主要措施。随着影像学技术的进步，螺旋CT、PET-CT等检查及异常凝血酶原(DCP)、血清甲胎蛋白异质体(AFP-L3)等新的血液分子标志物的应用，肝癌诊断的敏感性和特异性有所提高，但临床上对早期HCC的诊断能力仍十分有限，因此亟待寻找一种检测早期HCC的新型诊断手段。

液体活检是近年来研究较多、技术逐渐完善的一种新型诊断方法，通过对体液(血液、尿液、泪液)中包含疾病信息的成分，如细胞外囊泡、循环核酸等进行分析，以获取患者疾病状态相关信息。液体活检样本获取方便，检测灵敏度高、特异性好，有较大发展潜力。

一、细胞游离DNA

细胞游离DNA(cfDNA)是一类长度120～160 bp的DNA片段，主要来源于凋亡或坏死细胞。肿瘤患者血液中的cfDNA主要来源于坏死的肿瘤细胞，这部分DNA与其来源的肿瘤细胞具有相同的突变类型。对HCC患者血清中的cfDNA进行深度测序能够检测到在HCC中高频突变的癌基因及抑癌基因。

(一)cfDNA突变 Cohen 等[3]建立的“CancerSEEK”方法利用61-扩增子板多重聚合酶链式反应扩增样本，进而对包括肝癌在内的8种肿瘤中的16个高频突变基因进行分析，并通过单分子免疫检测平台检测8种蛋白标志物(每种标志物在至少一种肿瘤中高表达)，能有效、可靠地从健康对照中鉴别肿瘤患者。结果显示，在44例肝癌患者中(89%为HCC)，CancerSEEK特异度为60%，灵敏度为97%，对其中5例早期肝癌患者(I期)的诊断灵敏度为100%。

全球超过50%的原发性肝癌与HBV感染有关。Qu等[4]通过联合循环cfDNA上的体细胞突变、HBV整合、cfDNA浓度及血液中的蛋白标志物(AFP和DCP)与年龄、性别等多种因素，开发出了一种能够诊断早期HCC的液体活检方法 “HCCscreen”。 他们首次对HCC高危人群进行分析，将HBsAg(+)、血液AFP> 20 ng/mL或/和US检测到肝脏存在可疑结节,但增强MRI/CT未诊断HCC的患者定义为高危人群。在这类高危人群组成的训练集中，HCCscreen具有良好的诊断效能(AUROC=0.93；灵敏度85%，特异度93%)。在331例AFP正常、US无可疑结节的HBsAg(+)患者中，成功鉴定出了4例HCC患者，这些患者均处于疾病早期(结节<3 cm)，诊断灵敏度为100%(4/4)，特异度为94%(307/327)，阳性预测值为17%。但 “HCCscreen”是否适用于HBsAg阳性者之外的其他人群，有待验证。

(二)cfDNA表观遗传学改变 近年来发现，cfDNA特定基因的异常甲基化及羟甲基化修饰可作为HCC的诊断标志物。由于甲基化修饰带来的基因沉默效应，HCC患者cfDNA异常甲基化主要出现在HCC相关的抑癌基因上。考虑到肿瘤患者cfDNA上同样可检测到与原发肿瘤细胞相一致的甲基化及羟甲基化修饰改变，Xu等[5]开发的10个基因甲基化标志物组合能从健康对照、HBV/HCV感染患者、脂肪肝患者中鉴别HCC患者，其灵敏度与US相当；该团队开发的由8个基因甲基化标志物组成的联合预后评分系统还能用于HCC患者预后预测，从而调整患者治疗方案。

有报道发现，包括肝癌在内的不同肿瘤细胞来源的甲基化cfDNA在患者出现临床症状前即可存在于患者血液[6]。近期Chen等[6]开发了一项基于cfDNA甲基化的多癌筛查技术“PanSeer”，该技术通过半靶向PCR技术构建cfDNA测序文库，解决了传统重亚硫酸盐转化技术进行甲基化测序时DNA损失率较高、灵敏度低等问题，能够高效、灵敏地检测微量cfDNA上477个基因组区域中10 613个CpG位点的甲基化情况。在98例未确诊肿瘤之前1～4年采集的患者血液样本中，该诊断方法的检测灵敏度达95%。

除甲基化外，近年来研究人员也注意到cfDNA羟甲基化修饰在HCC诊断中的潜在作用。DNA羟甲基化是甲基化DNA的5-甲基胞嘧啶被催化形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)的过程，5-hmC可作为一种稳定的表观遗传学标记，在基因的转录调控、染色体重编程中发挥重要作用，与肿瘤的发生密切相关。Cai等[7]从血浆cfDNA中筛选了由32个基因组成的5-hmC标志物组合，基于此开发的加权诊断模型被证明可用于HCC患者与健康人及其他肿瘤患者的鉴别。

二、循环非编码RNA

非编码RNA(ncRNA)由长度>200 bp的长链非编码RNA(lncRNA)和长度在18～22 nt的微小RNA(miRNA)构成，细胞的恶性转化伴随lncRNA、miRNA的表达异常。其中存在于体液中的循环miRNA是研究最广泛的一种短链ncRNA。Zhou等[8]检测了934例参与者，其中包括健康受试者、慢性乙型肝炎(CHB)患者、肝硬化(LC)患者和HBV相关HCC患者，包含miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a和miR-801在内的一组miRNA能够准确区分不同BCLC分期的HCC患者，灵敏度和特异度分别达到了82%和84%。该组miRNA同样准确区分了HCC患者与健康受试者、CHB和肝硬化患者。

Tan等[9]对来自血浆和外泌体的RNA进行了测序、分析，发现除miRNA外，多种血浆ncRNA亦可作为HCC诊断和预后的生物标志物。这类血浆ncRNA可能因为特殊的二级结构或与RNA结合蛋白结合而未被RNA酶降解，具有生物学活性，如其中的RN7SL1 S片段可促进肿瘤细胞增殖，并发现这些循环ncRNA能够灵敏、特异地区分HCC、CHB和健康受试者。

三、细胞外囊泡

细胞外囊泡(EVs)可由细胞主动释放至细胞外环境，包含多种具有生物活性的脂质、蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、DNA成分，能够介导细胞间通讯。其中，外泌体是研究最广的一类EVs，其直径约为30～150 nm，可存在于血液、唾液、尿液和母乳中。

包括肿瘤细胞在内的所有细胞都能释放外泌体，但其成分在疾病和生理状态下存在显著差异。研究表明，外泌体中部分miRNA与蛋白质参与了HCC的发生、迁移、侵袭，并且在HCC中有特异性的表达。由于外泌体的膜性结构能够保护内含的miRNA、lncRNA免受RNA酶降解，其在体液中的稳定存在使外泌体核酸成分较单纯的循环核酸更具有优势。Cho等[10]发现肿瘤细胞来源的外泌体miR-10b-5p可作为HCC的早期诊断生物标志物(AUROC= 0.934；灵敏度90.7%，特异度75.0%)。除miRNA外，研究较多的外泌体环状RNA(circRNA)也可作为诊断标志物。例如，Wei等[11]报道了circRNA_101237的表达与肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关，具有作为HCC诊断标志物的潜力。

四、循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞(CTCs)是指自发或者因诊疗操作自肿瘤原发灶或者转移性病灶脱落进入外周血液循环系统的肿瘤细胞。对CTCs进行测序能够反映参与HCC上皮-间质转化、迁移及治疗后的复发等进程的相关差异基因，并且能够较好地反映肿瘤在患者体内的动态变化，在HCC的早期诊断中具有一定意义[12]。随着检测技术的不断进步，CTCs的检测也越来越方便，在HCC 其他肿瘤的早期个性化诊断中有十分广阔的应用前景。需要注意的是，不同肿瘤患者之间、同一患者不同肿瘤部位，甚至同一肿瘤不同肿瘤细胞之间均存在明显的异质性。

五、挑战与展望

近年来的多项研究已经证实了液体活检在HCC诊断中极具潜力的应用价值。相较于AFP、DCP等传统的HCC无创筛查指标，基于血浆cfDNA、RNA及细胞外囊泡等成分的液体活检方法具有灵敏度高、特异性好等优势，能够在HCC疾病早期予以检出。但是，需要注意的是，尽管循环血中的cfDNA上的遗传学或表观遗传学改变能够较灵敏、特异地诊断HCC，但研究人员仍需警惕诊断过程中假阳性事件的发生。一个可能的原因是由于慢性肝炎(如HBV、HCV)或肝硬化患者的cfDNA中也可能存在HCC相关突变或病毒基因整合事件，即部分驱动突变在HCC发生前已存在；而在健康人群中，循环cfDNA中的JAK2、TP53、KRAS突变可来源于造血细胞[13]，从而增加了假阳性事件的发生。临床医生在利用cfDNA突变进行肿瘤诊断时，或需同时对配对的外周血细胞进行基因分型以排除来源于造血细胞的突变，或者结合HCC特异性突变(CTNNB1、AXIN1等)辅助诊断，避免误诊。

慢性乙型肝炎、肝硬化患者是HCC的高危人群，对这类患者的筛查进行定期HCC筛查监测，有助于HCC的早期发现、早期诊断及早期治疗，具有较高的效益成本比，同时也是提高肝癌疗效的关键[1]。如HCCscreen用于HBsAg(+)的无症状社区人群的HCC筛查可检出AFP和CT难以诊断的早期HCC患者。最近的一项国际多中心的研究显示[14]，基于患者年龄、性别及实验室检测指标白蛋白、胆红素测定和血小板计数的风险预测模型“aMAP”，可以将不同病因的慢性肝病患者进一步划分为肝癌低危和高危人群。这种对高危人群的精细界定可能有助于进一步提高液体活检阳性预测值过低的问题。

目前，液体活检从样本采集、处理、质量控制到数据分析的各个过程仍有待进一步简化、规范化与标准化，如外泌体、cfDNA等提纯方法需要统一。此外，如何在不影响CTCs特性的情况下予以分离同样是亟待解决的问题。

近年来随着对这类诊断方法研究的不断深入，其诊断成本也在逐渐下降。希望在不久的将来，液体活检技术能够成功运用到临床HCC的早期诊断中，使患者得到及时治疗，从而改善预后。