低深度拷贝数变异测序在胎儿先天性心脏病中的应用研究

黄杏玲 王远流 邓新娥 陈惠 刘百灵 梅燕

(柳州市妇幼保健院围产保健科，广西 柳州 545001)

胎儿先天性心脏病(congenital heart disease,CHD)是最常见的出生缺陷，遗传综合型的CHD同时还伴有神经发育障碍、生长发育障碍等表现，手术后仍不能获得正常的生活质量[1-3]。基于NGS 技术的基因组拷贝数变异测序(copy number variation sequencing，CNV-seq)为产前诊断提供了新的手段，为胎儿CHD遗传病因的发现提供新的技术。本研究旨在评价CNV-seq分析技术在产前诊断CHD 致病基因中的临床应用价值，探索CHD与染色体亚显微异常的关系，为CHD的早期诊断、治疗和遗传阻断提供依据。报告如下。

1 资料与方法

1.1研究对象 2017年1月至2019年5月在柳州市妇幼保健院进行超声颈项透明层的检查和/或系统彩超或针对胎儿超声心动图检查等，被产前超声诊断为胎儿心脏异常伴或不伴心外异常的孕妇。本研究已通过医院伦理审查委员会的审查。纳入标准：(1)经两名具有产前超声诊断资质的医师诊断胎儿心脏结构异常伴或不伴心外异常的孕妇(2)经产前遗传咨询并知情同意行介入性产前诊断。排除标准：(1)有介入性产前诊断禁忌或拒绝产前诊断的孕妇(2)心脏表型只涉及心律失常或心包积液的胎儿或重度地贫的胎儿。最终纳入研究病例181例，其中孤立性CHD146例，伴有心外异常的CHD35例；孕周17+2周-34+3周，平均孕周(23.7±2.9)周；年龄16～44岁，平均年龄(29.8±5.6)周。

1.2研究方法 (1)染色体核型分析：所获取的羊水和脐血进行细胞培养后，以G显带染色(必要时加做C显带或N显带)制备染色体标本,每例标本按照ISCN(2016)标准,油镜下分析20个分散好、中等长度的中期分裂相,发现嵌合体或异常核型时加数到100个分裂相。(2)CNV-seq检测：①提取基因组DNA；②DNA文库构建；③上机测序；④生物信息学分析；然后通过检索 UCSC、DECIPHER、OMIM、Clin Var、DGV、PUBMED等数据库进行CNV临床意义的确定。

2 结 果

2.1胎儿CHD染色体异常结果 染色体核型分析检出染色体非整倍体或结构重排共有20例(20/181，11.0%)，包括15例染色体非整倍体(21-三体最常见)，3例染色体大片段的缺失，1例嵌合体、1例22号染色体短臂异染色质。CNV-seq分析技术检出染色体拷贝数异常43例，检出率为23.8%(43/181)，其中有明确致病意义的为15.5%(28/181)，临床意义不明的为3.9%(7/181)，良性变异CNV有8例。染色体核型分析正常的161例CHD 胎儿中，CNV-seq分析技术检出8例染色体拷贝数微缺失/微重复，检出率为5.0%(8/161)。

2.2染色体核型分析正常的CHD胎儿中8例致病性CNV结果分析 病例编号13是法络氏四联症，右位主动脉弓，动脉导管未见显示，CNV-seq分析提示22q11.21处缺失片段大小为2.9Mb区域，包含 22q11 deletion syndrome的全部，涉及TBX1、CDC45L等多个致病基因。病例编号41是胎儿室间隔缺损，CNV-seq分析提示16号染色体p13.3-13.13处重复11.42Mb区域，包含Chromosome 16p13.3 duplication syndrome，主要涉及CREBBP、ABAT等多个致病基因。病例编号50是胎儿肺动脉干增宽，CNV-seq分析提示1号染色体q43-q44处缺失5.86Mb区域，包括了AKT3、NLRP3等多个OMIM基因。病例编号78是胎儿心脏异常，CNV-seq分析提示7号染色体q11.23处缺失1.70Mb区域，包含 Williams-Beuren Syndrome (WBS)的全部，涉及OMIM基因有NCF1、ELN、SVAS、ADCL1。病例编号114是胎儿法洛四联症、永存左上腔静脉、十二指肠梗阻，CNV-seq分析提示2号染色体p16.1-p14处缺失4.48Mb区域，主要涉及SLC1A4、EHBP1等致病基因；病例编号137是永存左上腔静脉Ib型，CNV-seq分析提示22号染色体q13.2-q13.33处缺失7.94Mb区域，该区域主要涉及SHANK3,PSAP2等多个致病基因；病例编号144也是永存左上腔静脉Ib型，CNV-seq分析提示5号染色体p15.33处缺失4.42Mb区域，主要涉及SLC9A3、SDHA等基因。

3 讨 论

本研究中，181例 CHD 胎儿进行了染色体核型分析及CNV-Seq分析，G显带核型分析显带水平为320-400条带，可以较准确地检测大于10Mb的染色体数目和结构的异常，染色体核型分析异常染色体检出率为11.0%(20/181)。而通过CNV-Seq分析技术，有明确临床致病意义的染色体畸变为15.5%(28/181)，临床意义不明确的为3.8%(7/181)。染色体核型分析正常的CHD致病性CNV检出率5.0%(8/161)。邓璐莎等[4]研究57例胎儿先天性心脏发育异常的病例中，NGS测序检查出CNV结果异常的为19.30%；Zhu等[5]对115例CHD 胎儿进行产前诊断，18.3%(21/115)的致病性CNV被检测出。Jansen FA等[6]一项meta分析表明染色体核型正常的CHD胎儿额外检出的致病性CNV为7.0%。这些研究均表明，CHD除了与常见的染色体非整倍体如21-三体等相关外，与染色体亚显微结构异常密切相关，CNV-seq技术可以提高胎儿CHD染色体异常的检出率。2019年我国专家共识[7]推荐CNV-Seq技术作为产前诊断的一线技术。因此，对胎儿CHD进行产前诊断，染色体核型分析方法分辨率有限，不能检出10Mb以下染色体亚显微结构异常，而CNV-seq技术可作为补充染色体核型分析的有效技术，提高胎儿CHD染色体畸变的检出率，有助于临床医师进行产前遗传咨询和风险评估。

在本研究中，CNV-seq分析检出8例致病性 CNV，片段大小为1.7-11.42Mb，均含有致病性基因。最常见的为22q11.2微缺失，涉及TBX1、CDC45L等多个致病基因，而TBX1基因是22q11.2微缺失综合征大部分临床表型的分子病理基础，是圆锥动脉干畸形最常见的综合类型[8]，这些遗传综合征型的CHD胎儿出生后还可表现为智力障碍、生长发育异常等多种功能障碍，而胎儿时期，CHD只是这其中表型之一。遗传综合征型的CHD涉及多个致病基因，严重影响胎儿CHD的预后，对家庭及社会都是一种沉重的负担。对胎儿CHD进行致病CNV的研究，对评估胎儿的预后有重要的意义。虽然CNV-Seq是分析基因组拷贝数变异的高分辨率检测工具，从速度、自动化程度、极少的样本量、覆盖面和分辨率上都比传统的细胞遗传学方法有很大程度的提高。但是CNV-Seq分析也有局限性，不能有效测出基因组平衡的染色体倒位及易位、不能检测一些特殊的三倍体及一些低比例嵌合体、检出意义不明的CNV(variants of Unknown significance，VUS)等。VUS是CNV-Seq检测胎儿CHD的额外发现，CNV-Seq技术在胎儿CHD产前诊断的应用给临床带来最大的困难也就是VUS的解释。

综上所述，运用CNV-Seq技术对胎儿CHD进行产前诊断，较传统的染色体核型分析方法能显著提高染色体畸变的检出率,鉴定疾病相关性CNV，为进一步了解CHD的发病机制提供理论依据，也为CHD的早期诊断、治疗和遗传阻断提供临床证据。