流式细胞术检测HLA-B27阴阳性判读标准的建立及灰区样本的基因型分析

吴蓓颖， 顾燕英， 范臻佳， 蔡 刚

（上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025）

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是目前检测人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-B27最常用的方法，其检测速度较快、通量较大。然而，在实际工作中，许多实验室发现以试剂盒推荐的临界值判断患者HLA-B27的阴、阳性，与患者基因型相对照，会漏检相当一部分HLA-B27阳性的患者[1]。流式反向序列特异性寡核苷酸探针（flow reverse sequence specific oligonucleotide，Flow-rSSO）法分型的错误率为0.159%，低于聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）的分型错误率（0.684%）[2]。因此，本研究拟结合FlowrSSO的分型结果来设定FCM检测HLA-B27的阴、阳性判读规则，以及对灰区样本的进一步处理方式，并探讨灰区样本的特性。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年8月—2018年5月上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科、伤科、康复科门诊就诊的腰背关节痛患者132例，其中男69例、女63例，年龄17～82岁。

1.2 仪器与试剂

FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（美国BD公司）及配套HLA-B27（HLA-B27 FITC/CD3 PE）检测试剂。Luminex 200多功能流式点阵仪（美国One Lambda公司）及配套HLA-B分型试剂。ABI 9700 PCR扩增仪（美国ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集 采集所有对象静脉血3 mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝。抗凝全血2～8 ℃保存不超过1周。分离的样本DNA -18 ℃保存不超过2年，-70 ℃可长期保存，避免反复冻融。

1.3.2 流式细胞术检测 取50 μL抗凝血，加入30 μL HLA-B27荧光抗体，室温孵育30 min，加入2 mL溶血素，室温放置15 min以裂解红细胞，300×g离心5 min，弃上清，用2 mL磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤细胞2遍，加500 μL PBS重悬细胞，上机检测，以CD3-藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的T淋巴细胞设门，获取10 000个细胞，采用配套软件进行分析，计算细胞HLA-B27的平均荧光强度，与试剂盒提供的临界值进行比较，以低于临界值判定为阴性，高于临界值10以上为阳性，高于临界值0～10判定为灰区。以d值（荧光强度的均值与校准磁珠中位值的差值）大小来判断样本的阴、阳性。

1.3.3 Flow-rSSO法检测 提取每份样本的全血基因组DNA，采用多重PCR进行扩增，将产物与包被了特异性寡核苷酸探针的磁珠杂交，洗脱非特异性结合的DNA，重悬磁珠，采用Luminex 200多功能流式点阵仪检测，并用配套软件分析患者HLA-B位点的基因分型。

1.4 统计学方法

采用Excel 2016及SAS 9.0软件进行统计分析。用GLM相关性分析评估不同型别B27与荧光强度的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FCM与Flow-rSSO法检测结果的比较

132例患者按FCM试剂盒推荐的阴阳性判读规则得出的HLA-B27结果分别为阴性（d＜0）63例（47.74%）、灰区（d值为0～10）45例（34.09%）、阳性（d＞10）24例（18.18%）。采用Flow-rSSO法检测132例患者的基因型，结果显示，63例FCM阴性样本中有28例（44.4%）基因型为B27，其余35例均为其他型别的HLA-B基因型；45例FCM灰区样本基因型均为B27，24例阳性样本2种方法检测结果一致，因此FlowrSSO法的阳性率为73.48%（97/132）。

2.2 FCM判读规则的拟定

以Flow-rSSO法检测结果为HLA-B27××作为HLA-B27阳性的判断标准。FCM以可以判定全部结果为非B27的道数为阴性，以可以判定全部结果为B27的道数为阳性，不能明确结果的道数范围拟定为灰区。见表1。

表1 FCM不同d值结果与Flow-rSSO法结果的比较及灰区拟定

2.3 d值重复性实验

选取20个FCM道数分布在83～186范围内的样本进行d值重复性实验，所有样本的检测d值的差值均≤2，故将灰区的d值上、下界限各扩大2。见图1。

图1 重复性实验结果

2.4 3种判定规则判定效能的比较

以Flow-rSSO法基因分型检测的结果作为判读标准，比较FCM试剂盒推荐的阴阳性判定值（0≤d≤10）、拟定灰区判读规则（-5＜d≤0）及扩大拟定灰区判读规则（-7＜d≤2），以低于灰区的判读规则为阴性，以高于灰区的判读规则为阳性。结果显示，拟定灰区和扩大拟定灰区判定阴、阳性结果的准确性为100%。列入扩大拟定灰区的样本数比拟定灰区增加了19例（14.4%），以HLA-B7、HLA-B37及HLA-B27为主。见表2、表3。

表2 FCM试剂盒推荐判定值与拟定灰区及扩大拟定灰区判定效能的比较 例

表3 拟定灰区与扩大拟定灰区样本的基因型分析例（%）

2.5 HLA-B27各型别d值的比较

采用FCM检测基因型为HLA-B27的样本，其HLA-B27抗原强度并不相同，但按基因分型进行比较，不同基因型别之间的d值差异无统计学意义（P＞0.05）。携带的B27的个数不同，其荧光强度的d值差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 HLA-B27不同基因型别d值的差异

3 讨论

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种慢性炎性脊椎关节病，主要累及骶髂关节及中轴关节，典型的临床表现为炎性腰背痛，致残率较高。由于早期发病隐匿，症状不特异，当确诊时往往已错过最佳治疗时机[3]。有研究结果显示，HLA-B27与AS密切相关，AS患者HLA-B27的阳性率＞94%，而正常人的阳性率＜10%，因此HLA-B27已成为临床上AS的早期诊断和鉴别诊断的重要辅助指标[4-6]。在国际脊柱关节炎（spondyloarthritis，SpA）评价工作组2009年6月发布的标准中，再次强调了HLA-B27的重要性，相对于传统的AS标准，SpA分类标准将诊断敏感性提升至82.9%，特异性为84.4%[7]。

HLA-B27是目前腰背痛患者的常规检测项目，虽然FCM因操作简单、检测快速、敏感性高及特异性高等优点而被各临床实验室广泛用于检测HLA-B27，但许多实验室发现，FCM检测AS患者的HLA-B27阳性率偏低，与国外文献报道[8]有一定差距。除去影像学错判导致临床误诊为AS外，另一个主要原因可能是HLA-B27 FCM检测结果的判读临界值不合适我国人群，从而导致阳性结果被错判为阴性。本研究结果显示，由于进口试剂盒设置的临界值偏高，导致有44.4%的阴性样本B27结果判定有误，且灰区的设立对阴、阳性的判定帮助不大。

按照FCM试剂盒的使用说明书要求，所有低于试剂盒推荐临界值的样本判定为阴性，高于临界值10的确定为阳性，高于临界值0～10判定为灰区，推荐采用备用方案重新检测[9-11]。本研究发现如果采用FCM试剂盒提供的阴、阳性判断标准，虽然24例阳性样本的Flow-rSSO法结果均为B27，45例灰区样本也均为B27，但在63例阴性样本中有28例（44.4%）Flow-rSSO法检测结果为HLA-B27，此28例患者中有20例未能被明确诊断，有4例虽然FCM检测HLA-B27的结果为阴性，但临床依然作出了AS的诊断，仅有4例患者有其他与AS无关的明确诊断，与SpA分类标准中HLA-B27诊断AS的特异性（84.4%）相近。由此可见，准确的HLA-B27检测结果有助于临床的诊断，错误的结果往往会使临床医生对诊断产生疑惑。基因检测可以说是HLA-B27判定的金标准。采用实时荧光定量PCR对HLA-B27位点进行扩增，可以得出阴、阳性的结论，但是会漏检一些少见型别的B27，如果要囊括全部型别，则会使PCR检测数明显增多，工作量成倍增加[12-13]。Flow-rSSO法可对HLA-B位点进行分型，通过计算机进行大量的数据分析，将不确定度降低至1%，与实时荧光PCR相比，不但准确度有所提高，而且可以对B27阳性的样本作更深入的分型确认，对非B27的样本也能给出具体的型别鉴定结果，因此被不少研究中心作为HLA-B27基因分型的参考标准[14]。

Flow-rSSO法可以对HLA-B位点进行明确分型，但会导致常规HLA-B27检测成本增加。因此，对FCM试剂盒推荐的阴、阳性判读范围进行调整，得到适合本地区患者的判定临界值，采用分型的方法对灰区样本进一步检测，更为经济、高效。

本研究对132例样本的FCM结果进行分析，并以Flow-rSSO法的分型结果作为参考标准，结果显示，将灰区范围定在-5＜d≤0时，假阴性与假阳性率都为0，灰区样本HLA-B27的检出率为86.06%。收集20例FCM检测荧光强度分布在各区间的样本，每份样本检测3次，进行重复性试验，结果显示样本d值的最大值与最小值的差值≤2。因此本研究扩大了拟定灰区的范围，上、下界限各扩大2，将其定为-7＜d≤2，虽然灰区的样本数增加了9.8%，B27的检出率降至80.65%，但本研究认为这种判定方式可以更好地避免假阴性和假阳性。

本研究中临床未明确诊断为AS，但有AS相关症状的患者共90例。依据FCM试剂盒推荐值判定为阳性的患者有19例；依据FCM试剂盒推荐值判定为灰区的，用扩大拟定灰区直接判定为阳性的有23例，其基因型均为B27；2种方法都判定为灰区而基因型为B27的有9例；依据FCM试剂盒推荐值判定为阴性而本研究判定为灰区，通过进一步检测基因型为B27的有28例。这些相关症状包括但不仅限于腰痛、背痛、胸椎退行性变、骶髂关节炎、膝关节炎、膝关节退行性病变等。由此可见，准确的HLA-B27检测结果对于临床诊断有相当大的辅助作用。另外，有20例临床患者初诊为AS，其样本依据FCM试剂盒推荐的阴阳性判读标准，只有8例为阳性，按本实验室自建扩大灰区标准判读，新增5例灰区样本，基因型检测结果均为B27。

据文献报道，目前已发现HLA-B27亚型160种，依次命名为HLA-B27：01至161（无HLA-B27：22），分别由213个等位基因编码[15]。最常见的亚型为B2705、B2704及B2702，其中B2705是目前所知的所有亚型的原型，存在于所有种族中，而B2704在亚洲人群中为优势亚型[16-17]。本研究对样本的HLA-B位点分型结果作进一步分析，结果显示基因型为B27的样本共97例，检测到的型别有B2702、B2704、B2705、B2707、B2715，杂合子中最多的是B2704 [55例（56.70%）]，其次为B2705[34例（35.05%）]。通过分析不同基因型别的HLA-B27抗原的荧光强度，发现杂合子之间的d值差异无统计学意义（P＞0.05），而2例B2704纯合子的d值明显高于杂合子（F=6.01，P＜0.01）。由此推测影响FCM检测HLA-B27抗原强度的因素是位点个数而非种类。

本研究对在灰区范围内的样本进行基因型分析，结果显示，除HLA-B27外，还有HLA-B7和HLA-B37，这3个型别占灰区样本的96.77%。HLA-B7和HLA-B37的影响均属于交叉反应，其中HLA-B7隶属于交叉反应组[18-19]，而HLA-B37则属于非交叉反应组抗原，且与HLA-B27有交叉反应[20-23]。

FCM检测HLA-B27抗原的荧光强度与样本T细胞表面HLA-B27抗原表达量有关，去除基因型的因素后，推测这可能与人种差异有关。因此，进口试剂盒设定的临界值是否适用于我国人群还有待研究，其临界值设定过高，可能会漏诊相当一部分AS患者。不合适的灰区范围可能会造成过多的假阴性，过大的灰区范围又会对导致检测成本和工作量增加。因此，不同地域的实验室在确定HLA-B27的临界值时，可以以检测试剂盒提供的数据为参考，建立合适而准确的灰区范围判断体系，以便在最合理的条件下提高检测准确率。