有丝分裂原活化蛋白激酶对HER-2阳性乳腺癌化疗疗效考核价值

魏世刚 曾光群 彭倩 陈艳

据WHO调查显示[1]，2012年全世界范围内罹患乳腺癌的患者约有170万，其中与乳腺癌相关的死亡人数为50万。美国国立综合癌症网络[2]（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）乳腺癌临床实践指南中提出，手术及术前放、化疗依然是可切除乳腺癌的主要治疗手段。人表皮生长因子受体2（human epithelial growth factor receptor-2，HER-2）阳性乳腺癌约占所有乳腺癌的20%～30%[3，4]，HER-2阳性乳腺癌具有分化程度低、侵袭性高、预后差等特点，成为难治性乳腺癌分型之一。蒽环类化疗是HER-2阳性乳腺癌的主要方法之一，李迅等[5]报道称HER-2阳性乳腺癌较HER-2阴性乳腺癌更能从蒽环类化疗中获益。有丝分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）是调控HER-2/MEK/MAPK信号转导通路的蛋白激酶，能够介导HER-2阳性乳腺癌高增殖、高转移和高复发；而MAPK磷酸化（pMAPK）是激活此信号通路的关键[6，7]。本研究通过检测新行辅助化疗的HER-2阳性乳腺癌MAPK蛋白及磷酸化程度，探讨MAPK信号通路相关分子对乳腺癌新辅助化疗疗效及预后的评估价值，现将结果报告如下。

资料与方法

1 一般资料 选择2010年5月～2012年5月本院收治的83例HER-2阳性乳腺癌患者作为研究对象，均为女性，年龄23～68岁，平均（47.3±5.1）岁；按照美国癌症联合委员会[8]（American Joint Committee on Cancer，AJCC）乳腺癌TNM分级标准分为ⅡA期17例，ⅡB期39例，ⅢA期18例，ⅢB期9例。所有患者均接受FEC（表柔比星+氟尿嘧啶+环磷酰胺）新辅助化疗：静脉滴注表柔比星80 mg/m2，第1天；静脉滴注氟尿嘧啶500 mg/m2，第1天；静脉推注环磷酰胺600 mg/m2，第1天，化疗21 d为1个周期；患者接受2～4个化疗周期后休息1周行手术治疗，包括保乳手术11例，乳腺癌改良根治术37例，乳腺癌根治术35例。术中切除乳腺组织和癌旁组织，并制成病理切片保存待检。

2 纳入与排除标准

2.1 纳入标准：①所有患者术前经空芯针穿刺活检证实为HER-2阳性乳腺癌；②初治单侧乳腺癌患者，术前未接受放疗、化疗或内分泌等治疗；③临床资料完整；④治疗方案得到患者及家属同意，并签署知情同意书。

2.2 排除标准：①双侧乳腺癌；②既往接受过其他抗癌治疗者；③术前明确有临床远处转移；④凝血机制异常、近3个月大型手术史或合并全身严重感染者。

3 方法

3.1 组织MAPK、pMAPK蛋白检测：将术中收集的癌旁组织和癌组织切片，置于-20℃冰箱保存待检。采用免疫组化染色检测组织MAPK、pMAPK蛋白表达：二甲苯脱蜡、乙醇梯度洗脱，PBS冲洗3次；加入枸橼酸缓冲液（0.01 mol/L），微波抗原修复，3%H2O2孵育5 min消除内源性过氧化酶。加入3%山羊血清封闭液体，37℃孵育10 min弃去封闭液；分别滴加1∶2 000的小鼠抗人MAPK单克隆抗体（购自上海士锋生物科技有限公司）和1：500的兔抗人pMAPK单克隆抗体（购自上海新肽生物科技有限公司），4℃孵育24 h。加入FITC标记山羊抗小鼠IgG作为二抗，37℃孵育50 min，DAB显色液显色，自来水反复冲洗，复染，封片。结果判定：由两位病理科医生采用盲法阅片，显微镜下随机选择10个视野，采用半定量法[9]进行评分；染色强度：无染色代表0分，浅色代表1分，棕黄色代表2分，深色代表3分。着色细胞所占百分比：染色细胞＜5%代表0分，染色细胞5%～25%代表1分，染色细胞26%～50%代表2分，染色细胞51%～75%代表3，染色细胞＞75%代表4分；以染色强度×染色细胞百分比作为总分，其中总分0分代表阴性，1～4分代表弱阳性。5～8分代表阳性，9～12分代表强阳性；总分≥1分代表蛋白表达阳性。

3.2 组织MAPK、pMAPK mRNA检测：取约50 mg样本组织，达成匀浆，选用Trizol试剂盒提取匀浆总RNA，提取方法按照试剂盒说明书；采用紫外分光光度法、5%琼脂糖电泳检测总RNA完整性。在逆转录体系中加入0.5 μg总RNA，37℃反应60 min合成cDNA，再将总反应物94℃灭活5 min，-20℃保存待检。实时荧光定量PCR检测组织MAPK、pMAPK mRNA表达水平，引物委托武汉博士德生物工程有限公司合成，MAPK上游：5＇-GGGTCAAAGATCACGTGCACAG-3＇，下游：5＇-TTGTCAAAGCAGACGGAGGTC-3＇，扩增片段长度216bp；pMAPK 上游：5＇-CGGAAGACTGTGTCGAGCAA-3＇，下游：5＇-GGATCAAGCGCACTGTGGA-3＇，扩增片段长度195bp；GAPDH 上游：5＇-GGTGAACGTGCGTCTCAAGC-3＇，下游：5＇-GTCGGTGGTGGAAGATCGTC-3＇，扩增片段长度121 bp。PCR反应体系：DNA提取物1 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，Taq酶1 μL，延伸体系2 μL，ddH2O 15 μL，上下游引物各0.5 μL，总反应体系23 μL。反应条件：96℃预变性1 min；95℃变性60 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；最后72℃ 10 min；以GAPDH为内参照进行校正，计算目的基因相对表达量。

3.3 临床资料收集与疗效评价：以患者年龄、手术方式、临床分期、月经、雌激素受体、MAPK、pMAPK表达等作为观察指标，单因素分析影响乳腺癌化疗疗效的因素，再将变量指标代入Cox回归模型，分析影响化疗疗效的危险因素。术后6周采用参考RECIST 1.1版实体瘤疗效评价标准[10]对化疗疗效进行评价，完全缓解（CR）：所有目标病灶消失；部分缓解（PR）：基线病灶长径总和缩小≥30%；进展（PD）：基线病灶长径总和增加≥30%或出现新病灶；稳定（SD）：基线病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达PD；其中临床有效=CR+PR。

3.4 随访：本研究对83例乳腺癌患者进行随访，化疗结束第2天开始，观察患者无复发生存时间，定义无复发生存时间为乳腺癌确诊之日至患者出现复发或远处转移时间；随访截止日期为2015年7月31日。

4 统计学处理 应用SPSS22.0统计软件，计数资料以率（%）表示，率的比较采用χ2检验或fishers确切概率法；患者生存分析采用Kaplan-Meier法，组间比较采用Log-Rank test；多因素采用Cox回归模型进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 癌组织与癌旁组织MAPK、pMAPK蛋白表达 免疫组化染色显示，癌组织MAPK、pMAPK蛋白表达均显著高于癌旁组织，两组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

表1 乳腺癌组织与癌旁组织MAPK、pMAPK蛋白表达[n（%）]

2 癌组织与癌旁组织MAPK、pMAPK mRNA表达RT-PCR法检测显示，癌组织MAPK、pMAPK mRNA相对表达量（0.879±0.173和0.613±0.057）均高于癌旁组织（0.743±0.078和0.287±0.031），两组间比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

3 疗效评价 83例乳腺癌患者中，CR 15例占18.1%，PR 45例占54.2%，SD 22例占26.5%，PD 1例占1.2%，临床有效共计60例占72.3%。

4 影响新辅助化疗疗效的单因素分析 单因素分析显示，化疗疗效与年龄、手术方式、临床分期、绝经状态、雌激素状态无关；MAPK、pMAPK蛋白阳性患者临床有效率显著低于MAPK、pMAPK阴性患者（P＜0.05），见表2。

5 新辅助化疗疗效的多因素分析 多因素分析显示，MAPK、pMAPK蛋白阳性表达是影响乳腺癌化疗疗效的独立危险因素（P均＜0.05），见表3。

6 MAPK、pMAPK蛋白表达与生存预后的关系 全组83例患者均获得随访，随访时间8～43个月，中位随访时间25.9个月；随访期间复发转移17例，总死亡时间10例，73例患者存活。MAPK阳性患者3年无复发生存率为41.8%，MAPK阴性患者为60.7%，MAPK阳性3年无复发生存率低于MAPK阴性（χ2=11.037，P=0.000）；pMAPK阳性患者3年无复发生存率为39.1%，pMAPK阴性患者为58.7%，pMAPK阳性3年无复发生存率显著低于MAPK阴性（χ2=4.103，P=0.041），见图2。

表2 单因素分析影响新辅助化疗疗效的因素

表3 肝癌预后影响因素单因素分析

讨 论

手术及术前化疗被认为是具有手术指征的乳腺癌患者治疗的首选方案，然而并非所有乳腺癌患者均能取得满意的化疗疗效。临床调查显示[11]，约有35%～55%的乳腺癌患者化疗反应性不佳，导致化疗失败，甚至因治疗延误而使患者错过最佳治疗时间窗，因此准确评估化疗疗效对及时调整治疗方案具有重要的指导意义。HER-2阳性乳腺癌约占所有乳腺癌的20%～30%。刘夏等[12]报道乳腺癌细胞内HER-2基因过表达，会导致细胞膜上HER-2蛋白产生过多，进而引起肿瘤细胞快速增殖，增加肿瘤细胞的侵袭性，因此HER-2阳性乳腺癌也被认为是预后差的一种乳腺癌类型。国外研究证实[13]，HER-2/MEK/MAPK信号通路与HER-2阳性乳腺癌预后差有关，HER-2/MEK/MAPK信号通路被激活，会介导乳腺癌细胞高增殖、高侵袭、高复发等恶性生物学行为。梁红玲等[14]对HER-2阳性乳腺癌给予曲妥珠单抗靶向治疗，结果发现MAPK信号通路异常活化及MAPK磷酸化与乳腺癌细胞耐药、后期复发密切相关。本研究显示，癌组织MAPK、pMAPK蛋白表达显著高于癌旁组织，癌组织MAPK、pMAPK mRNA相对表达量亦显著高于癌旁组织，说明HER-2阳性乳腺癌MAPK处于高活化状态，MAPK磷酸化程度显著升高。国外亦有学者[15]认为MAPK及MAPK磷酸化状态能够作为HER-2阳性乳腺癌化疗耐药的评估依据之一。

研究显示[16]，HER-2阳性乳腺癌较HER-2阴性乳腺癌更能从蒽环类新辅助化疗中获益。含蒽环类或紫杉醇的新辅助化疗药物依然是我国治疗HER-2阳性乳腺癌的首选药物。蒽环类化疗药物能够特异性地抑制细胞内拓扑异构酶Ⅱ，使肿瘤细胞DNA复制受阻。然而临床上依然发现约有10%以上HER-2阳性乳腺癌患者对蒽环类化疗药物无效[17]，此类患者若继续给予原有化疗方案，不仅使治疗无效，甚至会导致治疗延误。MAPK是以脯氨酸为导向的丝苏氨酸激酶，当受到丝裂原刺激能够介导MAPK活化，并磷酸化一系列下游信号分子，如JNK、c-fos、c-myc等，参与调控细胞的增殖和分化。国外最近一项研究证实[18]，蒽环类药物亦有抑制MAPK磷酸化激酶的作用。体外培养细胞实验证实[19]，蒽环类药物通过抑制MAPK磷酸化，降低下游磷酸化的级联效应，从而抑制肿瘤细胞增殖抗原Ki-67的表达，达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。本研究的多因素分析显示，MAPK、pMAPK表达水平是影响乳腺癌化疗疗效的独立危险因素，提示MAPK信号通路中关键分子MAPK、pMAPK均可以作为评估HER-2阳性乳腺癌化疗疗效的指标。王晶晶等[20]证实，对于部分HER-2阳性乳腺癌患者，其本身MAPK磷酸化程度不高，导致蒽环类药物抑制磷酸化和细胞增殖作用相对较低，这可能是HER-2阳性乳腺癌对蒽环类新辅助化疗疗效不佳的原因。这也间接证实了MAPK、pMAPK作为评估化疗疗效的潜在临床价值。

本研究对83例患者进行随访，结果显示MAPK蛋白阳性、pMAPK蛋白阳性患者无复发生存率均显著缩短，提示MAPK、pMAPK表达与患者生存预后负相关。Zhang等[21]报道，作为HER-2/MEK/MAPK信号通路关键基因，MAPK活化和磷酸化对整个信号通路的转导、激活至关重要。MAPK活化和磷酸化后，能够磷酸化多种信号转导蛋白，起到类似磷酸化“瀑布”作用，进而介导肿瘤细胞的增殖、分化。Luo等[22]也证实MAPK、pMAPK表达增加使MAPK信号通路活化，乳腺癌细胞内紧密连接蛋白表达下调，导致细胞侵袭转移能力增强，从而影响患者预后。联合本研究结果，可以初步认为MAPK、pMAPK亦可以作为HER-2阳性乳腺癌生存预后的评估指标。当然，本研究随访时间较短，仅观察了患者无复发生存期，其对远期总生存期的评估价值依然待进一步证实。

综上所述，MAPK、pMAPK表达与HER-2阳性乳腺癌患者化疗疗效及预后有关；MAPK通路相关分子MAPK、pMAPK可以作为HER-2阳性乳腺癌患者化疗疗效及生存预后的评估指标之一。