人组织激肽释放酶在消化系统肿瘤中的表达及预后价值

万涛，郑军，姚汝铖

（三峡大学第一临床医学院/三峡大学 肝胆胰外科研究所，湖北 宜昌 443003）

消化系统肿瘤是世界上发病率和病死率较高的一类疾病，常见的消化系统肿瘤主要为食管癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和胰腺癌等，由于这些肿瘤早期无特殊症状，等到病情发作时大多数已属中晚期，严重影响并危害着人民生活健康。虽然手术仍是消化系统肿瘤的主要治疗方法，但许多手术患者都存在不同程度的肿瘤侵袭、转移，使治愈的可能性大大降低，而且术后复发、转移的风险明显增大。根据国际癌症研究机构（IARC）的估计，全世界消化系统恶性肿瘤导致了近30%的癌症相关发病率和约40%的癌症相关病死率[1]，因此，探寻一种能够早期发现、有助于诊断和治疗消化系统肿瘤以及准确评估肿瘤预后的新型肿瘤生物学标志物显得尤为重要。近年来研究发现，人组织激肽释放酶（human tissue kallikrein，KLKs）与消化系统肿瘤的发生、发展以及侵袭和转移密切相关[2]，并大胆预测KLKs可以作为消化系统肿瘤标志物应用于疾病的早期疾病筛查、诊断、个性化治疗以及预后判断等临床实践中。本文就KLKs作为消化系统肿瘤标志物的研究进展进行综述，以期为消化系统肿瘤的诊断与治疗提供新的思路。

1 人组织激肽释放酶概述

人组织激肽释放酶（KLKs）属于丝氨酸蛋白水解酶家族的S1A亚型，是一种具有胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶性质的蛋白水解酶亚群，最早由Kraut等于20世纪30年代在胰腺中发现，其编码基因位于染色体19q13.3-13.4，由15个成员组成（KLK1～KLK15），各成员之间基因序列、蛋白质水平及三级结构均极为保守，分别编码相应的KLK1～KLK15蛋白[3]。KLKs在人的体液和各种组织中广泛表达，但由于其表达具有显著的差异性，导致KLKs在不同的部位发挥着不同的生理功能，如细胞外基质重塑、激素的调节、神经系统的塑造、皮肤表皮细胞脱落与再生、各种生长因子的裂解激活、血压和电解质平衡的调节等。近年来的研究发现，KLKs与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移过程密切相关，在肿瘤微环境中扮演着重要角色，并且部分KLKs已经作为肿瘤标志物应用于癌症的早期筛查、早期诊断以及治疗方案选择、预后判断等临床实践中[4]。例如KLK3又名前列腺特异性抗原（prostate specfic antigen，PSA）已经作为前列腺癌标志物广泛应用于临床筛查、诊断、预后和监测中[5]；而KLK13已被报道为乳腺癌和卵巢癌中独立、有利的预后标志物，并且作为胃癌细胞对化疗反应的预测标志具有潜在的临床效用[6]。

2 KLKs与消化系统肿瘤

2.1 KLKs与食管癌（esophageal cancer，EC）

食管癌（EC）是一种主要来源于食管上皮组织的恶性肿瘤，分为鳞状细胞癌、腺癌和未分化癌。据统计，全球的EC患者中几乎有一半来自中国[7]，而在我国EC的发病率仅次于肺癌和胃癌，且以食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）最为常见。Bhoola等[8]使用免疫细胞化学和原位杂交技术发现KLK1与ESCC的肥大细胞和巨细胞中缓激肽B1和缓激肽B2受体的过表达有关，这项研究结论支持KLK1和激肽受体不仅在EC中表达，并且可能在这类肿瘤的发生发展过程中起着关键作用。除KLK1外，相关研究还发现KLK6和KLK10与EC紧密相关。Yousef等[9]通过基因表达序列分析（SAGE）及EST表达图谱分析确定KLK6 mRNA表达在EC中显著提高；Grin等[10]通过免疫组化发现，与邻近的正常上皮细胞相比，KLK6在侵袭性胃食管腺癌中过度表达，此外EC标本中KLK10的细胞质染色强，而正常上皮组织的细胞质染色极弱甚至阴性，因此，KLK6、KLK10均可作为致癌基因蛋白在各种类型的消化系统肿瘤中过表达；Li等[11]采用RT-PCR和Western blotting检测83例EC细胞株中KLK10蛋白表达情况，研究发现KLK10的下调诱导了EC细胞株的S期阻滞，并促进了顺铂诱导的细胞凋亡。综合上述实验结果表明KLK6和KLK10均是很有前景的EC诊断标志物。

Nohara等[12]研究发现KLK13基因在ESCC中的表达水平显著低于相邻的正常食管黏膜，但是其在肿瘤组织的表达水平差异很大，免疫组化研究结果表明，ESCC中相对高水平的KLK13表达与细胞增殖、肿瘤进展和预后不良有关。Lin等[13]研究进一步证实ESCC组织中KLK13的mRNA表达水平下降说明其具有较高的肿瘤分级、较高的肿瘤坏死因子分级、更深的浸润程度和更多的淋巴结转移，KLK13的过度表达可以抑制ESCC细胞的侵袭和迁移能力，表明KLK13可能是EC的一个潜在诊断标志物；KLK13的mRNA表达水平的降低与生存率低密切相关，表明KLK13的mRNA表达可能是一个潜在的但不是独立的预后因素；KLK13的过度表达可以抑制ESCC细胞的侵袭和迁移从而发挥抗肿瘤作用，其作用机制可能与某些粘附蛋白上调、DNA甲基化有关。综上所述，我们大胆推测，KLK13可以作为抑制EC进展和改善患者预后的治疗靶点，同时也可以作为一个肿瘤诊断的生物学标志物指导治疗、评估预后。

2.2 KLKs与胃癌（gastric carcinoma，GC）

胃癌（GC）是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是我国第二大常见的肿瘤，占消化系统肿瘤的首位。尽管目前GC的术前新辅助化疗、手术治疗、术后联合化疗以及综合治疗等诊疗措施较前得到了不断地发展和完善，但其预后依然较差[14]。Zhu等[15]通过Western blotting发现KLK6在GC细胞中的表达水平显著高于正常胃上皮细胞，免疫组化显示KLK6阳性表达与GC患者的淋巴结转移发生率增加、肿瘤分化程度高低和TNM分期显著相关，KLK6表达阴性的患者比KLK6阳性表达患者有着更好地存活率。Liu等[16]研究发现KLK6在晚期GC组织中显著高表达，并与TNM分期、血管侵犯和神经周围侵犯密切相关；长期随访发现KLK6阳性患者的复发率和预后明显高于KLK6阴性患者；多因素分析显示，KLK6可作为临床上预测晚期GC术后肿瘤复发和预后的不利指标。综合以上研究可以得出，KLK6在体外促进胃癌细胞的生长、迁移和侵袭，未来KLK6可以作为胃癌新的生物学标志物指导临床诊治及预后评估。

Su等[17]研究发现，KLK7-siRNA沉默KLK7可抑制GC（AGS）细胞增殖，阻断G0/G1期细胞周期；Zhuang等[18]选择GC患者、胃良性疾患者和健康对照者各50例，采用酶联免疫吸附法检测三组患者血清KLK7和E-cad水平，得出结论：KLK7和E-cad参与了GC的发生和转移，且GC患者血清中KLK7表达与E-cad呈负相关，两者在GC的发生和转移中可能表现出拮抗作用，临床上联合测定血清KLK7和E-cad水平可作为监测GC病情进展及预后评估的指标。人们有望通过KLK7血清检测来监测GC患者的病情进展和评估预后。

Jiao等[19]运用RT-PCR法研究80例胃癌患者和80例正常胃组织患者中KLK10表达情况，发现在正常胃组织中KLK10低表达甚至不表达，而在胃癌中KLK10表达水平显著上调，KLK10基因表达上调是胃癌患者的独立预后因素。有研究表明，GC标本中KLK11 mRNA表达水平显著降低，KLK11表达阳性患者的DFS和OS远远高于KLK11阴性者，GC中较高的KLK11表达似乎与良好的预后相关，降低的KLK11表达是GC患者的不利预后因子，并且可能作为该疾病的新的独立预后标志物[20-21]。Zhao等[22]研究发现GC标本中KLK12 mRNA表达和KLK12蛋白均明显升高，KLK12蛋白的高表达水平与淋巴结转移、组织学类型以及肿瘤-淋巴结转移阶段密切相关，而与性别、年龄、侵袭深度、肿瘤大小无关；此外，生存分析实验显示，与KLK12表达降低的患者相比，KLK12表达水平升高的GC患者的5年生存率明显降低。综合上述实验结果，KLKs相关基因作为GC预后的新型生物学标志物具有很大的前景。

2.3 KLKs与结直肠癌（colorectal cancer，CRC）

结直肠癌（CRC）是消化系统常见的恶性肿瘤，目前它在全世界的发病率和病死率都高居前列，据统计仅2018年全球新发患者数就达到了近200万，而病死人数将近90余万[23]。大量的研究发现，KLKs中多种基因参与了CRC的进展过程[24]。Gratio等[25]通过免疫组化法显示KLK4在人结肠癌中表达并且在正常上皮细胞中不存在，其结果首次证明KLK4在CRC中异常表达并且能够在癌细胞中诱导PAR1信号传导。2013年Kontos等[26]使用qPCR分析CRC组织标本中KLK4 mRNA的表达水平，发现KLK4不仅与CRC的Dukes分期显著相关，还与肿瘤的侵袭、大小和组织学分级有着密切的联系，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，KLK4 mRNA的表达对患者DFS具有不利的预后价值，并能预测淋巴结阴性或早期CRC患者的短期复发。上述研究证明CRC中KLK4高表达预示复发风险增加，与淋巴结状态和肿瘤大小无关。

除了KLK4之外，Wu等[27]使用RT-PCR以及免疫组化法检测KLK5 mRNA的表达水平，发现KLK5在健康组织标本中几乎检测不到，但在CRC标本中呈过表达，并发现Dukes C/D期患者中KLK5表达水平显著高于Dukes A/B期的患者。Papachristopoulou等[28]研究也发现KLK5在非癌性结直肠组织中表达低下，而在CRC中其表达明显增加；此外，KLK5阳性表达与淋巴转移、晚期肿瘤和较高的组织学分级有关，KLK5阳性患者具有较低的DFS和OS。以上研究清楚地表明KLK5的表达与CRC预后有着重要的关联，是一种潜在的不良预后生物学标志物。Christodoulou等[29]研究发现KLK6 mRNA表达能够独立于患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学分级、肿瘤侵袭及TNM分期等临床指标而有效地预测不良DFS和OS，KLK6可作为CRC中独立的预后不良生物标志物；Petraki等[30]研究也证实了KLK6应被认为是KLKs家族中最有希望评估CRC预后的生物学标志物之一。除了上述KLKs基因，KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK14也被认为是CRC的不利预后生物学标志物[31-35]。

2.4 KLKs与原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）

原发性肝癌（PLC）是我国常见的恶性肿瘤之一，其病死率在消化系统肿瘤中位居第三位，主要包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和HCCICC混合型三种不同的病理类型。虽然血清甲胎蛋白（AFP）作为肝癌筛查和诊治的肿瘤标志物在临床上得到不断普及，为越来越多的肝癌患者赢得了手术时机，但PLC术后复发率依然很高，人们开始寻找更好的肿瘤标志物来早期发现肿瘤并评估预后。2011年Lavergen等[36]在第四届关于激肽释放酶和激肽释放酶相关肽酶的国际研讨会上提出，一些KLKs mRNA基因在肝脏标本中几乎检测不到，如KLK6、KLK7、KLK12，这些基因在肝脏的表达仅仅局限于乳腺癌或结肠癌等肿瘤的肝转移情况下，而其它的KLKs成员包括KLK5、KLK10、KLK11、KLK13和KLK14，其在正常肝组织和病理肝组织中表达均较弱，他们认为KLKs在正常组织中是沉默的，在肝硬化或HCC中也不太可能被重新转录而得到表达。然而，Lu等[37]的研究发现KLK10在HCC中异常甲基化，通过广泛的差异甲基化分析研究发现KLK10的高甲基化与肝硬化和丙型病毒性肝炎（HCV）感染显著相关，而与乙型病毒性肝炎（HBV）感染呈负相关；此外，KLK10表达的恢复阻碍了HCC细胞的基质非依赖性生长，并使它们对细胞毒性剂变得敏感。而另外一项研究发现，内源性KLKs结合蛋白Serpin4可以通过抑制血管生成抑制Hep G2细胞增殖并诱导细胞凋亡[38]。Navaneethan等[39]研究表明，KLK1在胆管癌中的含量低于健康对照组。现阶段关于KLKs在PLC的表达情况及预后价值的临床研究屈指可数，这就要求我们进一步深入研究KLKs作为潜在的肿瘤生物学标志物在PLC中的作用机制和表达调控情况，只有这样，KLKs在肝癌中的临床相关性才能得到充分阐明。

2.5 KLKs与胰腺癌（pancreatic cancer，PC）

胰腺癌（PC）是一种起病隐匿、恶性程度极高、诊断和治疗都很困难的消化系统恶性肿瘤，约90%为起源于胰腺腺管上皮的导管腺癌。由于缺乏有效的早期诊疗方法，导致近年来其发病率和病死率明显上升，据统计数据显示，截至2015年PC已成为我国第六大肿瘤死亡原因，并且呈现逐年上升趋势[40]，临床上迫切需要探寻一种敏感性和特异性更高的肿瘤标志物来提高PC的治疗效果和预后评估。与EC和HCC不同，KLKs表达与PC关系的相关研究很多。有相关研究报道，除了KLK1基因表达水平下调外，KLK6、KLK13基因在胰腺中高度表达[41]。2011年Linardoutsos等[42]在第四届激肽释放酶和激肽释放酶相关肽酶国际研讨会上提出，与良性胰腺组织相比，恶性胰腺组织中KLK4的mRNA表达水平也上调。Ruckert等[43]研究发现，与正常和良性胰腺组织相比，KLK6和KLK10在PC中的表达明显增加并且具有显著的差异性，通过基因表达实验、免疫组化以及Kaplan-Meier生存曲线证明KLK6和KLK10共表达对胰腺导管腺癌患者的OS具有不利影响，并且与R1切除状态显著相关。为了确定KLK10对胰腺癌微环境的贡献，Hammond等[44]使用siRNA介导的基因沉默KLK10的表达，发现KLK10表达抑制的克隆细胞在Boyden室测定中明显降低了细胞运动性，沿着FCS梯度迁移通过膜的细胞数量下降超过了50%[45]。尽管KLK6和KLK10共表达已显示出其作为PC预后的肿瘤标志物的有效性，但国内外关于单一因素下KLK10或KLK6表达与PC发生进展的机制研究甚少。

KLK7是近些年来被证明在PC中具有最突出的临床价值的生物学标志物和治疗靶点。Johnson等[46]在PC组织中检测到KLK7的过表达，并且通过RTPCR分析证实了其在癌性组织和健康组织之间表达的差异性。此外，Iakovlev等[47]通过免疫组化法分析正常胰腺组织、胰腺上皮内瘤变组织以及侵袭性腺癌组织中KLK7的表达情况，结果证实KLK7在从正常细胞到恶变前导管病变再到侵袭性腺癌的过程中其表达显著增加，相应的病死率也明显升高，该研究有力地证明了KLK7在PC组织中的高表达水平被认为是该疾病预后不良的标志物，其抑制可能代表潜在的治疗策略。Du等[48]在慢病毒实验中设计并构建shRNAs以敲除PC细胞系PANC-1中的KLK7，并使用实时细胞分析（RTCA）评估细胞增殖、迁移和侵袭能力，通过计算机辅助药物筛选发现了抑制KLK7的小分子并用来抑制PANC-1细胞，其结果证实KLK7在PC组织中的表达显著上调，并且敲低或者抑制KLK7能有效地抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。以上研究表明KLK7可能是治疗胰腺癌的潜在化疗靶点，这也充分证实了KLKs可作为胰腺癌潜在的肿瘤标志物指导治疗和预后评估。

3 结语与展望

综上所述，KLKs在消化系统肿瘤中异常表达，是一种潜在的可用于消化系统肿瘤早期疾病筛查、诊断、个性化治疗以及预后判断的新型肿瘤标志物。KLKs作为一个生物学靶点，可以通过调控某些生物学反应来促进或者抑制肿瘤的生长、侵袭及转移，但目前的研究多局限于KLKs相关基因参与消化系统肿瘤的表达与调控情况，而关于其具体的作用机制、调控通路及KLKs家族内部多种mRNA蛋白之间相互作用的具体机理尚未阐明。我们坚信，随着人们对于KLKs基因研究的更加深入，必然将极大地促进KLKs作为消化系统肿瘤标志物及预后评估因子的临床转化，从而为这些疾病的早期筛查、诊断、个性化治疗以及预后评估提供更加精准的治疗决策。