虎杖白藜芦醇的提取及抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的研究

丁华杰，叶云，安欢，高强，赵彬乐，罗容青，钟英英

(广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006)

虎杖，蓼科多年生草本植物，在我国主要分布于华东、华中、华南等地。虎杖是一种著名的中药植物和食品添加剂[1]，如虎杖的嫩茎可做蔬菜食用，其根可做饮料。白藜芦醇是虎杖的主要植物成分，是一种具有多种保健功能的多酚类天然化合物[2]，是生物体受到外界刺激时自身合成的[3,4]，并认为这种化合物的生成是植物体在受到感染或病原侵害时的一种反应，称为“植物抗毒素”[5]。白藜芦醇有较好的抗氧化、抗肿瘤活性等作用[6,7]。近年来，白藜芦醇已成为预防癌症的首选营养物质，在食品、膳食补充剂、保健品等领域中有重要的价值[8]。

本研究以虎杖白藜芦醇提取率为考察指标，初步探讨了乙醇体积分数、料液比、微波温度、功率、时间对虎杖中白藜芦醇提取率的影响，选出最佳工艺，并探讨白藜芦醇对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的影响，为进一步探讨白藜芦醇的食理作用提供了依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白藜芦醇标准品：成都曼思特生物科技有限公司；阿卡波糖、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷等：上海源叶生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯；实验用水为超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备及白藜芦醇含量的测定

虎杖：购自广西柳州市谭中菜市，洗净，用万能粉碎机打粉，置于阴凉干燥处密封备用。称取虎杖粉1.00 g，按料液比1∶15(g/mL)加入体积分数50%的乙醇，微波设定条件为600 s、50 ℃、500 W，回收乙醇。用乙酸乙酯萃取浓缩的浸膏，在50～60 ℃下减压蒸馏至干燥，加入体积分数为50%的乙醇定容至100 mL，再取0.5 mL定容到50 mL，测定其吸光度。计算3次的平均提取率及RSD。白藜芦醇提取率的计算公式为：

式中：c为溶液质量浓度(μg/mL)；n为溶液稀释倍数；V为溶液体积(mL)；m为原料质量(mg)。

1.2.2 标准曲线的绘制

取白藜芦醇标准品0.010 g，配制成浓度梯度为0,0.8,1.6,2.4,3.2,4.0 μg/mL的对照品溶液。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制白藜芦醇标准曲线。

1.3 单因素试验

1.3.1 料液比对提取率的影响

准确称量1.00 g虎杖粉，乙醇体积分数为50%，微波条件设定为50 ℃、500 W、600 s，改变料液比的比例为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)，测定吸光度。

1.3.2 乙醇体积分数对提取率的影响

准确称量1.00 g虎杖粉，微波条件设定为50 ℃、500 W、600 s、料液比为1∶20，改变乙醇体积分数30%、40%、50%、60%、70%、80%，测定吸光度。

1.3.3 微波时间对提取率的影响

准确称量1.00 g虎杖粉，乙醇体积分数为50%，微波条件设定为50 ℃、500 W，料液比为1∶20，改变微波时间为400,500,600,700,800 s，测定吸光度。

1.3.4 微波温度对提取率的影响

准确称量1.00 g虎杖粉，乙醇体积分数和料液比分别固定为60%、1∶20，微波条件设定为500 W、600 s，改变微波温度为30,40,50,60,70,80 ℃，测定吸光度。

1.3.5 微波功率对提取率的影响

准确称量1.00 g虎杖粉，用体积分数60%的乙醇进行微波萃取，微波条件设定为50 ℃、500 W、600 s，改变微波功率为300,400,500,600,700,800 W，测定吸光度。

1.4 正交试验设计

根据单因素试验结果，设计L9(34)正交试验[9]，以白藜芦醇提取率作为指标，确定白藜芦醇提取的显著影响条件并进行验证试验。

1.5 白藜芦醇提取液对α-淀粉酶活性的影响

1.5.1 葡萄糖标准曲线绘制

配制浓度梯度为0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL的葡萄糖溶液，按照赵丛丛等[10]的方法绘制葡萄糖标准曲线。

1.5.2 α-淀粉酶活力测定

参照文献[11]建立反应体系：在70 ℃条件下将1 mL α-淀粉酶(0.436 mg/mL)、1 mL 1%淀粉溶液分别预热5 min，继续混匀反应5 min；加入2 mL DNS，沸水浴5 min后，待溶液冷却至室温后加水稀释至50 mL，500 nm下测定吸光值，试验重复3次。

1.5.3 α-淀粉酶米氏常数

改变淀粉溶液的浓度：1/0.40，1/0.35，1/0.30，1/0.25，1/0.20，1/0.15，1/0.10，1/0.05 mg/mL，按照酶活测定体系操作，500 nm下测定吸光值，根据标准曲线求出相应的还原糖量，得出不同底物浓度(s)下的反应速度(v)，最后用双倒数法作图得到米氏常数。

1.5.4 白藜芦醇对α-淀粉酶抑制试验

以上述方法，按表1操作，在反应体系中加入0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL的白藜芦醇提取液。沸水浴显色后，待降至室温，定容至10 mL，测定吸光值。

表1 白藜芦醇对α-淀粉酶活性抑制体系表Table 1 Inhibition system of resveratrol on α-amylase activity mL

白藜芦醇提取液对α-淀粉酶的抑制率：

考虑到白藜芦醇提取液中乙醇的影响，配制不同体积分数的乙醇，测定乙醇对酶的抑制率，根据得到的乙醇抑制曲线选取合适的乙醇体积分数溶解提取物浸膏，稀释成不同浓度的溶液，用来进行α-淀粉酶的抑制试验，根据吸光值计算抑制率。然后绘制阿卡波糖抑制曲线、白藜芦醇提取液抑制曲线以及消除乙醇作用后的白藜芦醇提取液实际抑制曲线。

1.6 白藜芦醇对α-葡萄糖苷酶活性的影响

1.6.1 对硝基苯酚最大吸收波长测定

取对硝基苯-α-D-葡萄糖苷0.151 g，取pH为6.8的磷酸缓冲液溶解并定容至50 mL，得母液，浓度为10 mmol/L。取1 mL上述溶液定容至100 mL，取1 mL加入1 mol/L的Na2CO3溶液2 mL，混匀后于300～500 nm处扫描吸收光谱。

1.6.2 对硝基苯酚标准曲线绘制

用PBS将母液分别稀释为50,60,70,80,90,100 μmol/L。于400 nm处测定其吸光度，绘制对硝基苯酚标准曲线。

1.6.3 α-葡萄糖苷酶活力测定

参考相关文献[12,13]建立反应体系：0.5 mL 1% α-葡萄糖苷酶、1 mL底物PNPG(1 mmol/L)分别在60 ℃水浴中预热10 min后混匀，反应10 min后加入2 mL Na2CO3(1 mol/L)，并在400 nm处测定吸光值，试验重复3次取平均值。

1.6.4 α-葡萄糖苷酶米氏常数

改变底物浓度：1/0.8,1/0.7,1/0.6,1/0.5,1/0.4,1/0.3 mmol/L，按1.5.3的方法操作，于400 nm测定吸光值，然后用双倒数法作图得到米氏常数。

1.6.5 白藜芦醇对α-葡萄糖苷酶抑制实验

参照1.5.3的方法建立反应体系，见表2。在反应体系中加入0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mg/mL的白藜芦醇提取液。待反应终止用蒸馏水依次定容至10 mL，于400 nm处测其吸光度值。

表2 白藜芦醇对α-葡萄糖苷酶活性抑制体系Table 2 Inhibition system of resveratrol on α-glucosidase activity mL

白藜芦醇提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率：

考虑到白藜芦醇提取液中乙醇对试验的影响，配制不同体积分数的乙醇，测定乙醇对酶的抑制率，根据测得的乙醇抑制曲线，选取合适的乙醇体积分数溶解提取物浸膏，然后稀释成不同浓度的溶液，用来进行体外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性试验，根据吸光值计算抑制率。制作阿卡波糖抑制曲线、白藜芦醇提取液抑制曲线、减去乙醇作用后的白藜芦醇提取液修正抑制曲线。

2 试验结果与分析

2.1 白藜芦醇最大吸收波长的测定和标准曲线的绘制

白藜芦醇在300～310 nm的吸收光谱图见图1。

图1 白藜芦醇在300～310 nm的吸收光谱图Fig.1 Absorption spectrum of resveratrol at 300～310 nm

白藜芦醇标准曲线见图2。

图2 白藜芦醇标准曲线Fig.2 Standard curve of resveratrol

由图2可知，线性回归方程为y=0.1746x+0.0051，R2=0.9998，在0～4.8 μg/mL浓度范围内标准曲线线性良好。

2.2 重复性试验

3次试验测得白藜芦醇的平均提取率见表3，RSD<10%，表明该方法重复性良好。

表3 重 复试验数据记录表Table 3 Record form of repeated experimental data %

2.3 单因素试验结果

由图3可知，提取白藜芦的醇最适料液比是1∶20。由图4可知，提取白藜芦醇的最佳时间为600 s。由图5可知，提取白藜芦醇的最适乙醇体积分数是60%。由图6可知，白藜芦醇的最适提取温度是50 ℃。由图7可知，提取白藜芦醇的最适微波功率是700 W。

图3 料液比对白藜芦醇含量的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the content of resveratrol

图4 微波时间对白藜芦醇含量的影响Fig.4 Effect of microwave time on the content of resveratrol

图5 乙醇体积分数对白藜芦醇含量的影响Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on the content of resveratrol

图6 微波温度对白藜芦醇含量的影响Fig.6 Effect of microwave temperature on the content of resveratrol

图7 微波功率对白藜芦醇含量的影响Fig.7 Effect of microwave power on the content of resveratrol

2.4 正交法优化

正交试验因素水平设计见表4，正交试验结果见表5。

表4 正交试验因素与水平设计表Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment design

表5 正交试验结果Table 5 Orthogonal experiment results

由极差R的大小得出因素的影响大小为A>B>D>C，最佳的提取工艺为A2B2C3D3，即乙醇体积分数为60%，料液比为1∶20，微波条件设定为50 ℃、700 W、700 s。按照最佳工艺条件平行提取3次，得到白藜芦醇平均提取率为2.14%，见表6。

表6 验证试验结果Table 6 Verification experiment results %

2.5 白藜芦醇提取液对α-淀粉酶活性的影响

2.5.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线见图8。y=21.487x-0.0116，R2=0.9992，曲线在0～0.0462 mg/mL浓度范围内线性关系良好。

图8 葡萄糖标准曲线Fig.8 Standard curve of glucose

2.5.2 α-淀粉酶活力测定

表7 α-淀粉酶活测定结果Table 7 Determination result of α-amylase activity

由表7可知，按照反应体系操作完毕后，500 nm下测定吸光值，平行测定3次，α-淀粉酶的一个酶活力单位为0.280 mg，即3571 U/g。

2.5.3 α-淀粉酶米氏常数

图9 α-淀粉酶的Lineweaver-Burk曲线Fig.9 Lineweaver-Burk curve of α-amylase

2.5.4 α-淀粉酶抑制试验

不同体积分数的乙醇对α-淀粉酶的抑制率见图10，考虑到大于30%的乙醇溶解白藜芦醇不利于做抑制试验，故可选用10%或20%。

图10 乙醇对α-淀粉酶的抑制曲线Fig.10 Inhibition curve of ethanol on α-amylase

图11 白藜芦醇提取物对α-淀粉酶的抑制曲线Fig.11 Inhibition curve of resveratrol extract on α-amylase

由图11可知，当溶液浓度为0.6 mg/mL时，白藜芦醇提取液抑制率为89.56%，消除乙醇作用后，实际抑制率为69.42%。阿卡波糖在溶液浓度为0.3 mg/mL时抑制率达86.13%。

2.6 白藜芦醇提取液对α-葡萄糖苷酶活性的影响

2.6.1 对硝基苯酚标准曲线

图12 对硝基苯酚标准曲线Fig.12 Standard curve of p-nitrophenol

对硝基苯酚标准曲线见图12，可得线性回归方程y=0.0061x+0.0054，R2=0.9994，在0～100 μmol/L浓度范围内线性关系良好。

2.6.2 α-葡萄糖苷酶活力

由表8可知，将上述反应体系加入碳酸钠，并在400 nm下测定吸光值，平行测定3次，α-淀粉酶的一个酶活力单位为4.39 mg，即228 U/g。

2.6.3 α-葡萄糖苷酶米氏常数

图13 α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲线Fig.13 Lineweaver-Burk curve of α-glucosidase

2.6.4 白藜芦醇提取液对α-葡萄糖苷酶抑制试验

图14 乙醇对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线Fig.14 Inhibition curve of ethanol on α-glucosidase

不同体积分数的乙醇溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图14，考虑到用来溶解白藜芦醇的乙醇浓度不宜过高，否则会影响后续的抑制试验，故选用10%的乙醇。

图15 白藜芦醇提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制曲线Fig.15 Inhibition curve of resveratrol extract on α-glucosidase

白藜芦醇提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图15，浓度为0.3 mg/mL时白藜芦醇的抑制效果最佳，实际抑制率达到74.39%，略高于同浓度的阿卡波糖的抑制效果。

3 结论

正交试验结果显示，微波法萃取虎杖中白藜芦醇的最佳提取工艺为：料液比1∶20，乙醇体积分数60%，微波参数设置为700 W、50 ℃、700 s。在此条件下，白藜芦醇平均提取率达2.14%。

体外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性试验表明，虎杖白藜芦醇具有较好的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性作用。0.6 mg/mL的白藜芦醇对α-淀粉酶的实际抑制率为69.42%。而浓度低于0.3 mg/mL的白藜芦醇对α-葡萄糖苷酶的抑制效果略好于同浓度的阿卡波糖，其中浓度为0.3 mg/mL白藜芦醇的抑制效果最佳，实际抑制率达到74.39%。

本研究通过单因素及正交试验优化白藜芦醇提取条件，并对其体外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性进行研究，为虎杖中白藜芦醇被进一步开发为膳食补充剂提供了一定的试验依据。