响应面法优化藜麦中生物碱的提取工艺

刘树兴，李浩恒，任益平

(陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

藜麦又称南美藜、奎藜等。原产于南美安第斯山脉的高原地区。相比于其他谷物，藜麦中蛋白质含量高达12%～23%[1]，且富含人体必需的9种氨基酸，其中赖氨酸含量达到4.5%～7.0%，远高于大米和小麦。钙、镁、锌、铁等矿物质的含量均高于玉米和小麦，可溶性铁的含量几乎达到寻常谷物的2倍[2]。由于其丰富的营养价值，在国际上被称为“超级谷物”[3]，已用于面包、面条和调味品的加工中[4]。目前在我国的西藏、青海、四川、陕西等地多有种植。

生物碱类物质主要来源于双子叶植物，如黎科、罂粟科[5，6]、小檗科等。藜科植物含有喹喏里西定类生物碱和酰胺类生物碱[7]。其具有抗菌、抗肿瘤、降血压、稳定神经等作用[8]。除此之外，生物碱还是一些香辛料植物的有效成分[9]。前人在文殊兰、苦豆子、菊叶香黎、花椒、白屈菜等中进行了生物碱的提取与含量测定[10-14]，结果表明，文殊兰中提取率最低，为3.422 mg/g，白屈菜中提取率最高，为19.2 mg/g。有关藜麦生物碱的研究国内报道甚少，为开发利用藜麦资源，本试验对藜麦生物碱的提取方法进行了探索，以期为藜麦生物碱类物质的开发提供参考。

1 材料

1.1 试验试剂

藜麦：产自四川阿坝州金川县；盐酸小檗碱标品：上海源叶生物科技有限公司；三氯甲烷、甲醇、氨水、无水乙醇、硅钨酸等试剂：均为分析纯。

1.2 仪器

CS-700型高速多功能粉碎机 永康市天祺盛世工贸有限公司；CP213型电子分析天平 奥豪斯仪器(常州)有限公司；KQ-300B型超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；101-1AB型电热鼓风干燥箱 天津市泰斯特仪器有限公司；SHB-III S型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；RE52CS-1型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

2 方法

2.1 标准溶液的制备

对贾琦珍等[15]的方法进行修改，准确称取盐酸小檗碱对照品5.0 mg置于25 mL容量瓶中， 加入甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀。准确吸取该溶液10 mL置于25 mL容量瓶中，加入95%乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液。

2.2 盐酸小檗碱标准曲线的绘制

吸取对照品母液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL于50 mL容量瓶中，进一步用95%乙醇溶液定容，以95%乙醇为空白对照，于416 nm波长处测定其吸光度，以吸光度和盐酸小檗碱质量浓度求得回归方程。

2.3 藜麦生物碱得率的测定

准确称取提取物1 mg于100 mL容量瓶中用甲醇溶解定容，准确吸取5 mL此溶液置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇定容，在416 nm波长处测定吸光度，之后根据已得到的标准曲线计算生物碱得率。

式中：W为藜麦生物碱得率(mg/g)；X为盐酸小檗碱浓度(μg/mL);V为稀释液体积(mL)；N为稀释倍数；m为生物碱总提取量(g)；M为藜麦干粉质量(g)。

2.4 藜麦生物碱的提取方法

精确称取5.0 g藜麦干粉于碘量瓶中，加入一定体积及浓度的乙醇溶液，在300 W的超声功率下提取一段时间，超声后抽滤，除去脂溶性物质，再经旋转蒸发仪浓缩，浓缩液用2%的盐酸酸化，用1∶1体积的氯仿萃取去除杂质，水溶液用氨水调至pH 10～11，之后再用氯仿萃取，取氯仿层在50 ℃下鼓风干燥，即得藜麦生物碱总提取物。

2.5 藜麦生物碱的定性试验

取5 mg藜麦总生物碱提取物溶解于10 mL无水乙醇中，加入硅钨酸试剂，若出现结晶沉淀，则证明提取物中存在生物碱。

2.6 藜麦生物碱提取工艺的优化

2.6.1 单因素试验

2.6.1.1 液料比对藜麦生物碱得率的影响

液料比分别为10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g)，乙醇浓度为85%，液料混合后先静置浸泡5 h，然后在60 ℃的条件下超声提取40 min，研究液料比对藜麦生物碱得率的影响。

2.6.1.2 乙醇浓度对藜麦生物碱得率的影响

乙醇浓度分别为55%、65%、75%、85%、95%，液料比为20∶1，液料混合后先静置浸泡5 h，然后在60 ℃的条件下超声提取40 min，研究乙醇浓度对藜麦生物碱得率的影响。

2.6.1.3 提取温度对藜麦生物碱得率的影响

提取温度分别为40，50，60，70，80 ℃，乙醇浓度为85%，液料比为20∶1，液料混合后先静置浸泡5 h，然后超声提取40 min，研究提取温度对藜麦生物碱得率的影响。

2.6.1.4 提取时间对藜麦生物碱得率的影响

提取时间分别为10，20，30，40，50 min，乙醇浓度为85%，液料比为20∶1，液料混合后先静置浸泡5 h，然后超声提取，研究提取时间对藜麦生物碱得率的影响。

2.6.2 提取工艺响应面优化试验

在单因素试验的基础上，根据响应面试验设计原理，选取液料比、乙醇浓度、提取温度3个因素为试验因素，以藜麦生物碱得率为响应值，设计三因素三水平共17个试验组的响应面试验，采用Design Expert 8.0.6软件进行分析，得到模型回归方程，来确定藜麦生物碱的最佳提取工艺参数。响应面因素水平见表1。

表1 响应面试验水平和因素表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

3 结果与分析

3.1 藜麦生物碱的定性试验

在提取的藜麦生物碱配成的溶液中加入硅钨酸试剂，结果有明显的结晶型沉淀出现，说明此提取物中有生物碱存在。

3.2 盐酸小檗碱标准曲线的绘制

以盐酸小檗碱为标品绘制盐酸小檗碱标准曲线(见图1)，得到回归方程为：y=0.104x+0.003，相关系数R2=0.999，说明具有良好的线性关系。

图1 盐酸小檗碱标准曲线Fig.1 Standard curve of berberine hydrochloride

3.3 单因素试验

3.3.1 液料比对藜麦生物碱得率的影响

图2 液料比对藜麦生物碱得率的影响Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on the yield of quinoa alkaloids

由图2可知，其他条件一定时，液料比在10∶1～ 20∶1(mL/g)范围内，藜麦生物碱得率随液料比增大而增大；在此之后，当液料比继续增大时，生物碱得率呈减少趋势，说明溶解的生物碱达到饱和状态，从节约资源角度考虑，选择15∶1～25∶1 (mL/g)为液料比研究范围。

3.3.2 乙醇浓度对藜麦生物碱得率的影响

由图3可知，其他条件一定时，藜麦生物碱得率在开始时持续增加，当乙醇浓度达到85%时，藜麦生物碱得率达到了最大值，之后再增加乙醇浓度时生物碱得率反而减少，说明高浓度的乙醇会影响生物碱的溶出。所以选择75%～95%作为乙醇浓度研究范围。

图3 乙醇浓度对藜麦生物碱得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of quinoa alkaloids

3.3.3 提取温度对藜麦生物碱得率的影响

图4 提取温度对藜麦生物碱得率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of quinoa alkaloids

由图4可知，其他条件一定时，当温度小于60 ℃时，随着温度的增加，藜麦生物碱得率持续增加，之后，随着温度的继续增加，藜麦生物碱得率呈现减小的趋势。因此，选择50～70 ℃作为提取温度研究范围。

3.3.4 提取时间对藜麦生物碱得率的影响

由图5可知，其他条件一定时，随着提取时间的增加，藜麦生物碱得率持续升高，当提取时间达到40 min之后，藜麦生物碱得率出现了上下波动，在40，50，60 min的提取时间下，藜麦生物碱得率差别不显著。说明40 min后提取时间不再是藜麦生物碱得率的显著影响因素，为节约时间，提取时间选择40 min。

图5 提取时间对藜麦生物碱得率的影响Fig.5 Effect of extraction time on the yield of quinoa alkaloids

3.4 响应面试验结果

3.4.1 响应面试验设计及结果

利用Design Expert 8.0.6软件进行数据拟合，试验设计与结果见表2。

表2 试验设计及结果Table 2 Experimental design and results

3.4.2 模型的建立与显著性检验

利用Design Expert 8.0.6软件对响应面试验结果进行多元回归拟合，得到藜麦生物碱得率(Y)对自变量液料比(A)、提取温度(B)、乙醇浓度(C)的二元多项回归模拟方程：

Y=2.96+0.039A+0.11B+0.16C-0.16AB+0.055AC-0.26BC-0.54A2-0.30B2-0.52C2。

表3 响应面数据分析表Table 3 Response surface data analysis

注：“*”表示P<0.05，差异显著；“**”表示P<0.01，差异高度显著；“***”表示P<0.001，差异极显著。

由表3可知，该模型的P值<0.001，表示回归方程极其显著，失拟项的P值为0.0976，不显著，表明该模型能够很好地拟合试验数据。回归方程的决定系数R2=0.9681，调整决定系数RAdj2=0.9271，说明该拟合方程与实际情况之间差距较小，反映出了响应值与各因素之间不是简单的线性关系。通过拟合方程，可以得到各个因素之间存在一定的交互作用，其中B、C、AB均呈显著影响(P<0.05)，BC、B2呈高度显著影响，A2、C2呈极显著影响，A、AC均不显著。

从单因素水平看，得出的影响顺序为：C(乙醇浓度)>B(提取温度)>A(液料比)。各交互作用对藜麦生物碱得率的影响顺序为：BC>AB>AC。

3.4.3 响应面优化分析

响应面曲面图和等高线图由Design Expert 8.0.6软件绘制，各因素交互作用的响应面曲线图和等高线图，见图6。

图6 各因素交互作用对藜麦生物碱得率影响的 响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour maps of the interaction of various factors on the yield of quinoa alkaloids

由图6可知，乙醇浓度和液料比的交互作用对藜麦生物碱得率的影响显著，曲面呈钟罩形，而乙醇浓度和提取温度对藜麦生物碱得率的影响较小，图中曲面较平滑。藜麦生物碱得率随乙醇浓度及液料比呈现由低到高再降低的趋势，藜麦生物碱得率在合适的乙醇浓度及液料比下具有极大值，该值存在于相应曲面的顶部，通过软件对模型极值求解以及对等高线的分析可得最佳提取条件：液料比20.11∶1(mL/g)，提取温度61.34 ℃，乙醇浓度86.16%，提取时间40 min，在此条件下藜麦生物碱的最大理论得率为2.97 mg/g。考虑实际操作，最终确定最佳提取工艺条件为：液料比20∶1 (mL/g)，提取温度61 ℃，乙醇浓度86%，提取时间40 min，在此条件下进行3次平行试验，藜麦生物碱的平均得率为2.89 mg/g，与预测值误差为2.6%，因此可以证明响应面优化试验具有合理性。

4 结论

由响应面试验可知，藜麦生物碱的最佳提取工艺条件为：液料比20∶1(mL/g)，提取温度61 ℃，乙醇浓度86%，提取时间40 min，在此条件下藜麦生物碱得率为2.89 mg/g，与模型预测值相近，说明优化后的提取工艺对藜麦生物碱的提取具有一定的指导意义。