响应面法优化云南美味牛肝菌总黄酮的提取工艺研究

郭磊，尹须，加依达尔·努尔哈买提，岳家梦，华燕，阚欢

(1.西南林业大学 生命科学学院，昆明 650224; 2.西南林业大学 云南森林资源培育与利用协同创新中心，昆明 650224)

美味牛肝菌(BoletusedulisBall. ex Fr)又名大脚菇、网纹牛肝菌等，因外形酷似牛肝而得名，是世界著名的食药用野生菌之一，号称“牛肝菌之王”[1]。中国是美味牛肝菌的主要分布区域，主要分布于河南、四川、云南、内蒙古、福建和陕西等地[2，3]。美味牛肝菌不仅富含蛋白质、氨基酸、维生素等多种营养素[4]，而且风味独特，是制备天然化、营养化复合调味料的优质原材料[5，6]。另外，黄酮类化合物广泛存在于天然产物中，是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物[7]，具有显著的抗氧化功效，可以防治多种慢性疾病[8]，在调味食品和保健食品中也有一定的应用。

目前，对美味牛肝菌的营养成分及活性成分如多糖的研究较多[9]，但对于黄酮的相关研究鲜有报道。黄酮不仅是美味牛肝菌的主要活性物质，也是制备功能性调味料的主要成分，所以对于美味牛肝菌黄酮的研究就显得尤为重要。提取总黄酮的方法主要是乙醇浸提法[10，11]，因此，本研究采用乙醇浸提法提取美味牛肝菌总黄酮，并通过响应面优化试验建立总黄酮提取工艺的数学模型，获得最优的总黄酮提取工艺参数，为美味牛肝菌总黄酮的制备及进一步开发出功能性调味料提供一定的技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美味牛肝菌：云南易门县康源菌业有限公司；芦丁标准品：上海源叶科技有限公司；95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠：以上均为分析纯试剂。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准曲线的制作

参考刘芸等的方法并略微修改[12]。准确配制0,0.04,0.08,0.12,0.16,0.20,0.24,0.28,0.32,0.36，0.4 mg/mL的芦丁标品溶液1.00 mL，用70%乙醇定容至2.0 mL，然后分别与5% NaNO2溶液、10% Al(NO3)3溶液和4% NaOH溶液混合摇匀，静置后在510 nm波长处测定吸光值。以芦丁标品的浓度(C)为横坐标，以吸光值(A)为纵坐标，得标准曲线的回归方程为：A=1.2666C-0.0055,R2=0.9984。

1.2.2 总黄酮提取率的计算

准确吸取1.00 mL 美味牛肝菌提取液与1.00 mL无水乙醇混匀后，按照1.2.1标准曲线的制作方法测定吸光值，推算出美味牛肝菌提取液中总黄酮的提取率。

提取率=[(C×V×n)/(m×1000)]×100%。

(1)

式中：C为美味牛肝菌提取液中总黄酮的浓度，mg/mL；V为美味牛肝菌提取液的体积，mL；n为稀释倍数；m为美味牛肝菌的质量，g。

1.2.3 美味牛肝菌总黄酮的提取

1.2.3.1 单因素试验

云南美味牛肝菌子实体经干燥、粉碎过筛后备用。以总黄酮提取率为试验指标，采用单因素试验，探究液料比(mL/g)、提取温度(℃)、乙醇浓度(%)、提取时间(min)及提取次数对云南美味牛肝菌总黄酮提取量的影响。影响总黄酮提取率的因素设以下水平：固定提取温度80 ℃，乙醇浓度70%，时间90 min，提取2次，考察不同的液料比(15，20，25，30，35，mL/g)对总黄酮提取率的影响；固定液料比25(mL/g)，乙醇浓度70%，时间90 min，提取2次，考察不同提取温度(65，70，75，80，85 ℃)对总黄酮提取率的影响；固定液料比25 (mL/g)，提取温度75 ℃，提取时间90 min，提取2次，考察不同乙醇浓度(60%、65%、70%、75%、80%)对总黄酮提取率的影响；固定液料比25 (mL/g)，提取温度75 ℃，乙醇浓度70%，提取2次，考察不同提取时间(60，90，120，150，180 min)对总黄酮提取率的影响；固定液料比25 (mL/g)，提取温度75 ℃，乙醇浓度70%，提取时间120 min，考察不同提取次数(1，2，3 次)对总黄酮提取率的影响。

1.2.3.2 响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上，选择对云南美味牛肝菌总黄酮提取率影响较大的4个因素(液料比、提取温度、乙醇浓度和提取时间)，每个因素选取3个水平，根据Box-Behnken响应面设计原理，以总黄酮提取率为指标，因素水平设置见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

使用数据分析软件Design-Expert 8.0.6进行数据分析，通过F检验对试验数据进行方差分析以评价模型的统计意义并进行验证试验。

2 结果与分析

2.1 响应面法优化美味牛肝菌总黄酮的最佳提取条件

2.1.1 响应面回归模型的建立及分析

在单因素试验结果的基础上，以总黄酮提取率为响应值，选择影响总黄酮提取率的4个因素液料比、提取温度、乙醇浓度和提取时间为自变量，建立4因素3水平中心组合试验设计，结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Design and results of response surface experiment

采用Design-Expert 8.0.6对所得数据进行回归分析，回归结果分析见表3，对4个因素进行回归拟合后，得到回归方程：

Y=2.61+0.19X1+0.21X2-0.044X3-0.084X4+0.058X1X2-0.015X1X3+0.19X1X4-0.012X2X3-0.22X2X4+0.021X3X4-0.28X12-0.022X22-0.15X32-0.44X42。

(2)

由方差分析表3可知，该回归方程模型显著(P<0.05)，失拟项不显著(P>0.05)，说明该模型与实际拟合良好，并且所得方程与实际拟合中非正常误差所占比例小，可用该回归方程代替试验点对试验结果进行分析。结果表明，液料比(A)、提取温度(B)、液料比二次项(A2)和提取时间二次项(D2)对响应值影响显著。该回归模型可信度较高，可以利用该模型分析及预测总黄酮提取率随因素水平变化的波动情况。

2.1.2 交互作用的响应面分析

通过回归方程(2)做响应曲面图，见图1。通过该组动态图可对任何两因素交互影响总黄酮提取率效果进行分析和评价，并从中确定4个因素的最佳范围。

图1 两因素间交互作用对总黄酮提取率的响应面图Fig.1 Response surface figures of interaction between two factors on extraction rates of total flavonoids

图1中的6个图分别反映了液料比和提取温度、液料比和乙醇浓度、液料比和提取时间、提取温度和乙醇浓度、提取温度和提取时间、乙醇浓度和提取时间对美味牛肝菌总黄酮提取率的交互影响效应。由图1可知，总黄酮提取率随其中任意两个变量的增加均呈现上升趋势。

2.1.3 总黄酮提取工艺最佳参数的确定及验证

对回归方程求解，即美味牛肝菌总黄酮提取率达到最大值的工艺条件为：液料比30.34 (mL/g)、提取温度84.16 ℃、乙醇浓度69.99%和提取时间119.46 min，在此条件下总黄酮的提取率为2.834%。为方便实际操作将试验条件调整为：液料比30 (mL/g)、提取温度85 ℃、乙醇浓度70%和提取时间120 min，通过试验验证得出美味牛肝菌总黄酮的平均提取率为2.82%，与理论值相差0.49%，与模型预测值相近，说明该回归模型与实际试验过程匹配程度高，可以有效地优化美味牛肝菌总黄酮的提取工艺。

3 结论

在单因素试验结果的基础上，通过响应面试验优化得出美味牛肝菌总黄酮的最佳提取条件为：液料比30 (mL/g)、提取温度85 ℃、乙醇浓度70%和提取时间120 min，在此条件下美味牛肝菌总黄酮的提取率为2.82%，验证试验也反映出采用响应面法优化总黄酮的提取工艺方法可靠。本研究方法绿色环保、得率高，能为开发出含活性物质总黄酮的美味牛肝菌天然调味料提供技术依据，发展前景广阔。