三草尿毒灵通过调控Shh/Gli 信号通路表达减轻肾脏纤维化的实验研究*

周燕妮 苏雨田 许正锦

（北京中医药大学厦门医院 福建厦门 361000）

我国慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease,CKD）的流行病学调查结果显示，我国成人CKD 患病率约为10.8%[1]。在全球范围内，CKD 患者进展到终末期肾病（End Stage Renal Disease,ESRD）的数量每年递增。而随着糖尿病和肥胖症等代谢性疾病发病率的不断增长，CKD 的患病率将进一步上升[2]。CKD 已经成为“全球公共健康问题”。

肾小管间质纤维化（Tubulointerstitial Fibrosis,TIF）是肾脏受损时发生瘢痕化并重塑的病理过程。TIF 的病理特征是间质组织炎细胞浸润、肾小管萎缩、肌成纤维细胞激活及细胞外基质成分（Extracellular matrix,ECM）过度堆积，最终由瘢痕组织取代正常的肾脏结构，造成肾功能减退或丧失。大量的临床和实验数据表明，TIF 是导致肾功能逐渐丧失的主要决定因素，是各种病因引起CKD 的共同发病途径[3～5]，其病变程度与病情预后密切相关。

既往研究发现，Shh/Gli 信号在促进肾脏纤维化过程中发挥了重要作用，在多种肾纤维化动物模型中表达上调。如在肾缺血-再灌注（IRI）、单侧输尿管结扎（UUO）等多种肾脏疾病中Shh/Gli 信号都被重新激活[6～7]。此外，在人体肾脏病的标本中，也可以看到Shh 蛋白表达上调。因此，抑制Shh/Gli 信号的激活是防止肾脏纤维化的重要环节。

中医药在防治CKD 进展、延缓肾脏纤维化等方面有其独特优势[8～9]。三草尿毒灵是全国名老中医专家学术经验继承指导老师赵纪生教授的经验方，具有健脾益肾、泄浊排毒、活血化瘀的功效。前期的临床研究和动物实验表明，三草尿毒灵不仅可减轻临床症状，延缓CKD 的进展，还能有效减少血清透明质酸（HA）、Ⅳ型胶原和转化生长因子-β1（TGF-β1）的水平[10～13]。本研究通过动物实验，观察三草尿毒灵对Shh/Gli 信号表达的影响，从信号转导通路水平进一步揭示其抗肾纤维化的作用机制，为三草尿毒灵的临床应用提供基础理论依据。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性BALB/c 小鼠（体质量20～25 g）24 只，购于北京动物实验中心，饲养于厦门大学医学院动物实验中心SPF 级动物房，自由饮水。

1.2 药物 三草尿毒灵方由黄芪、葫芦巴、鱼腥草、鹿衔草、积雪草、大黄、黄连、法半夏、茯苓、枳实、川芎等组成，购于厦门市中医院中药房，煎煮并浓缩成含生药0.6 g/ml 的汤剂。Shh/Gli 信号小分子抑制剂环巴胺（Cyclopamine,CPN）购于美国Sigma-Aldrich公司。

1.3 分组、手术与用药 小鼠随机分为假手术组（简称Sham 组）、单侧肾缺血再灌注组（Unilateral Renal Ischemia/Reperfusion Injury,UIRI）、单侧肾缺血再灌注三草尿毒灵组（简称SCNDL 组）和单侧肾缺血再灌注CPN 组（简称CPN 组），各6 只。小鼠腹腔注射麻醉，暴露肾脏后分离肾蒂。Sham 组只暴露肾蒂但不夹闭肾蒂，用微型动脉夹夹闭左侧肾蒂30 min 构建单侧肾缺血再灌注模型。UIRI 组术后第3天起每天通过腹腔注射生理盐水，CPN 组术后第3天起每天通过腹腔注射CPN（按5 mg/kg 注射），SCNDL 组术后第3 天起每天灌胃三草尿毒灵汤剂（按0.15 ml/10 g 灌胃）。术后第10 天，麻醉小鼠后，暴露小鼠右肾，结扎肾蒂后切除右肾。假手术组只做肾包膜剥离，不做肾脏切除。在术后第11 天处死小鼠，收集血液和肾脏组织，用于后续检测分析。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 血肌酐及尿素氮水平检测 收集小鼠血液后，常温静置2 h，再2 500 rpm，4℃离心15 min，取上清液，用自动生化仪测量小鼠血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。

1.4.2 肾组织病理学检查 肾组织块浸入4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成3 μm 厚切片供常规Masson 染色及免疫组化检测，操作按说明进行。实验使用抗Shh 抗体（sc-9024）等抗体。

1.4.3 Western blot 检测蛋白表达 提取肾组织总蛋白，BCA 法测量蛋白浓度后进行电泳、转膜、封闭、孵育相应一抗：抗Fibronectin 抗体（F3648）、兔抗CollagenⅢ抗体（ab7778）、鼠抗α-SMA 抗体（A2547）、抗Shh 抗体（sc-9024）、抗Gli 1 抗体（AF3455）、抗α-tubulin 抗体（T9026），以及抗β-actin 抗体（MAB1501）；再孵相应二抗后用ECL化学发光液显影曝光，凝胶图像分析系统分析结果。

1.4.4 qRT-PCR 检测mRNA 的表达 用TRIzol 提取肾脏组织RNA 后，使用Promega 公司的试剂盒将RNA 反转录获得cDNA，再选择相应引物（见表1）进行qRT-PCR 反应。结果采用内参基因β-actin的表达量作为矫正。

表1 qRT-PCR 所用引物

2 结果

2.1 各组肾功能比较 肾功能检测结果表明，与Sham 组相比，UIRI 组血肌酐和尿素氮水平明显升高（P＜0.05）；与UIRI 组比较，SCNDL 组、CPN 组血肌酐和尿素氮水平明显降低（P＜0.05）；SCNDL 组与CPN 组血肌酐和尿素氮水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、表2。

图1 各组肾功能比较

表2 各组肾功能比较（n＝6，±s）

表2 各组肾功能比较（n＝6，±s）

2.2 各组肾脏间质纤维化情况比较 Masson 染色结果表明，UIRI 组、SCNDL 组、CPN 组肾脏间质纤维化面积均大于Sham 组（P＜0.05）；SCNDL 组与CPN 组肾脏间质纤维化面积均小于UIRI 组（P＜0.05）；SCNDL 组与CPN 组肾脏间质纤维化面积比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表3。

图2 各组肾脏间质纤维化情况比较

表3 各组肾脏间质纤维化评分比较（n＝6，分，±s）

表3 各组肾脏间质纤维化评分比较（n＝6，分，±s）

2.3 各组细胞外基质表达情况比较 UIRI 小鼠的肾组织中，无论是mRNA 水平还是蛋白水平，FN、COL-Ⅲ和α-SMA 表达水平均较Sham 组小鼠显著升高（P＜0.05）；SCNDL 组和CPN 组mRNA、蛋白水平，FN、COL-Ⅲ和α-SMA 表达水平均低于UIRI组（P＜0.05）；SCNDL 组、CPN 组mRNA、蛋白水平，FN、COL-Ⅲ和α-SMA 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3、表4、表5。

图3 各组细胞外基质表达情况比较

表4 各组肾组织细胞外基质表达情况比较（n＝6，±s）

表4 各组肾组织细胞外基质表达情况比较（n＝6，±s）

表5 各组肾组织纤维化蛋白表达情况比较（n＝6，±s）

表5 各组肾组织纤维化蛋白表达情况比较（n＝6，±s）

2.4 各组Shh/Gli 信号表达情况比较 qRT-PCR 检测结果显示，UIRI 组肾组织Gli 1 mRNA 水平较Sham 组明显升高（P＜0.05）；SCNDL 组和CPN 组Gli 1 mRNA 水平显著低于UIRI 组（P＜0.05）；同样，Western blot 检测显示SCNDL 组和CPN 组Gli 1蛋白表达低于UIRI 组（P＜0.05）。SCNDL 组和CPN组Gli 1 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4、表6。

图4 各组Shh/Gli 信号表达情况比较

表6 各组肾组织Gli 1 基因表达情况比较（n＝6，±s）

表6 各组肾组织Gli 1 基因表达情况比较（n＝6，±s）

3 讨论

Hedgehog（Hh）信号是一组进化上保守的发育相关信号，能够调节胚胎发育、组织稳态、损伤修复和肿瘤发生等多种生物学过程[14～15]。哺乳动物Hh 信号的配体有三种，分别为Shh、Ihh（Indian hedgehog）和Dhh（Desert hedgehog），其中Shh 的研究最为广泛。Shh 在细胞外通过与胞膜受体Patched 1（Ptch 1）相结合，诱导Ptch 1 内聚体形成和降解，使其丧失对Smoothened（Smo）蛋白的抑制作用，从而引起Smo 的激活。活化的Smo 蛋白经过多种步骤进一步激活Gli 转录因子家族。活化的Gli 转录因子进入细胞核内，诱导靶基因的转录。正常情况下，当肾脏发育完成后，Shh/Gli 信号变为静息状态。但当肾脏发生病变时，Shh/Gli 信号被重新激活促进肾脏纤维化。在既往的动物实验研究中，无论是UUO、阿霉素肾病（ADR）、5/6 肾切除模型，还是单侧肾缺血再灌注模型，激活的Shh/Gli 信号都会促进肾脏纤维化的发生及发展，而阻断Shh/Gli 信号则可抑制肾脏纤维化[16～17]。

成纤维细胞的激活在肾脏纤维化发生中有关键作用。在正常成年人肾脏中，成纤维细胞位于肾实质毛细血管丛和小管上皮细胞之间的间质区域内，其形态表现为星状形，并拥有多个细胞突起，连接于肾小管和毛细血管基底膜之间[18]。静息状态下，间质成纤维细胞膜表达CD73 抗原，能够产生促红细胞生成素，并且表达血小板来源生长因子受体β（PDGFRβ）和成纤维细胞特异蛋白1（FSP 1）。肾脏损伤时，成纤维细胞受到激活，细胞增殖异常活跃，同时其表型发生转变，表达激活状态特异的分子标志物α-SMA，并产生大量ECM 蛋白，成为肌成纤维细胞。那么肌成纤维细胞在肾脏受损后是如何激活的，便是肾脏纤维化研究领域中的一个关键课题。肾实质的主要组成细胞是肾小管上皮细胞，它们易受多种代谢紊乱、免疫反应、缺血、低氧和肾毒素刺激，是肾脏损伤的主要靶细胞[19]。有学者认为受损肾小管上皮和间充质成纤维细胞存在肾小管上皮-间充质细胞对话（EMC），从而引起成纤维细胞的表型改变。并且Shh 可能是介导EMC 的一个重要介质。在肾脏纤维化发生过程中Shh 在肾小管上皮细胞的表达明显增高，而它的靶细胞为成纤维细胞，能够诱导成纤维细胞活化。这些结果提示，肾小管来源的Shh 通过EMC 对成纤维细胞激活和增生可能起到了至关重要的作用。

三草尿毒灵全方通补兼施，方中既有黄芪、葫芦巴健脾温肾以扶正，又有鱼腥草、鹿衔草、积雪草、大黄清热解毒、通腑泄浊以祛邪；配以黄连、法半夏、茯苓、枳实顾护脾胃，使中焦枢纽运转正常，以防闭门留寇；又因久病多瘀，佐以川芎活血化瘀，血运通畅有利于浊毒之邪排出。正邪兼顾，补、泄融为一体，使补而不留邪，泄而不伤其正。此方不仅延缓了CKD的进展，而且对一系列并发的临床症状有明显的缓解和消除作用。

前期体外研究发现，三草尿毒灵能抑制Shh 引起的肾成纤维化细胞的增殖以及Shh 信号的传导。本研究发现，在单侧肾缺血再灌注模型中，UIRI 小鼠血肌酐和尿素氮水平明显升高，在分别给予三草尿毒灵和Shh/Gli 信号通路抑制剂CPN 治疗后，UIRI 小鼠的血肌酐和尿素氮水平明显下降，起到了保护肾功能的作用。此外三草尿毒灵和CPN 还可减轻UIRI 小鼠的肾脏细胞外基质的沉积，抑制肾脏纤维化进展。进一步研究发现，三草尿毒灵与CPN 一样，都可阻断Shh/Gli 信号通路等表达，从而改善肾脏纤维化。

总之，Shh/Gli 信号通路在促进肾脏纤维化的发生发展中发挥了关键作用，调控Shh/Gli 信号通路等表达是防止肾脏纤维化等的重要靶点。三草尿毒灵作为中药复方，含有多种有效成分，在延缓慢性肾脏病进展方面具有独特优势。前期研究表明本方具有减少ECM 形成、降低TGF-β1水平的作用。通过本次动物实验研究，进一步证实三草尿毒灵能保护单侧肾缺血再灌注小鼠的肾功能，并能阻断Shh/Gli信号通路的表达，从而减轻肾脏纤维化，说明其抗肾纤维化的作用机制与调控Shh/Gli 信号的表达密切相关。