肺癌组织中plagl2、ascl2的表达及临床意义

姚淑芳 董海平 黄慕超 林建锋

肺癌在世界范围内是最常见的恶性肿瘤之一，我国肺癌的发病率和死亡率均高居肿瘤的第一位[1]。肺癌的治疗手段包括手术切除、放疗和化疗等传统治疗及分子靶向疗法和生物治疗等新型治疗[2-3]，虽然其治疗效果具有一定程度的进展，但是肺癌的死亡率仍然居高不下，预后未见明显改善，5年生存率仅有15%左右[4]。肺癌的侵袭转移及治疗过程中出现的化疗、靶向药物的耐药和放疗抵抗，是患者预后较差的主要原因[5]，同时肺癌发病过程是复杂的，因此探索肺癌发生发展中发挥作用的一些重要分子，对提高肺癌患者治疗的敏感性及改善预后具有重要意义。多形性腺瘤基因样蛋白2(pleomorphic adenoma gene-like protein 2, PLAGL2)为转录因子，在多种肿瘤的发展中发挥重要作用[6-7]，数据库分析数据，显示在肺肿瘤中具有高PLAGL2表达的患者更容易被发现[8]。无刚毛鳞甲复合体样蛋白2(achaete-scute homologue 2, ASCL2)属于保守的转录因子，是wnt/β-catenin信号通路重要的靶基因之一[9]，wnt/β-catenin信号通路是调控肿瘤增殖、侵袭和转移等恶性行为的经典信号通路[10-11]，研究发现ASCL2在多种肿瘤中为致癌基因，在肺鳞癌中高表达[12]。PLAGL2和ASCL2在肺癌中的表达水平及是否具有相关性，引起我们的关注，因此本研究通过qRT-PCR和免疫组化检测PLAGL2、ASCL2在肺癌组织和癌旁组织中的表达情况，并分析两者在肺癌中表达的相关性及PLAGL2、ASCL2表达与患者临床病理参数和预后的关系，为PLAGL2、ASCL2可能作为肺癌治疗基因提供基础实验依据。

资料与方法

一、临床资料

收集2016年1月～2018年1月入住我院患者手术标本86例，标本收集纳入标准：首次行手术切除治疗，术前未接受放化疗和分子靶向治疗等任何抗肿瘤治疗，组织类型经2位以上病理专家证实，病例资料和随访资料完整。标本收集排除标准：合并其他类型肿瘤，具有传染病，患有威胁生命健康的严重疾病，其中患者年龄29～73岁，平均年龄(43.95±21.36)岁。经医院伦理委员会审核通过，患者均签署知情同意书。

二、 材料与试验方法

1 试剂与仪器 RNAsimple 总RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录、SYBR Premix Ex TaqTM qRT-PCR试剂盒等均购自日本TaKaRa公司；PLAGL2、ASCL2、内参GAPDH引物均由美国Invitrogen公司合成；兔抗人PLAGL2多克隆抗体(ab139509)，兔抗人ASCL2多克隆抗体(ab107046)均购自英国Abcam公司；DAKO试剂盒购自德国Darmstadt公司；DAB显色试剂盒、非免疫羊血清均购自上海碧云天生物技术有限公司；加拿大中性树胶，购于Solarbio公司。

2 qRT-PCR 收集手术切除的肺癌组织及远离肿瘤5 cm以上的癌旁组织，置于-80℃液氮中保存，根据RNAsimple 总RNA提取试剂盒说明书提取组织中总RNA。测得RNA浓度，根据PrimeScriptTM RT reagent Kit反转录试剂盒说明书将总RNA逆转为cDNA。PLAGL2引物F:GAGTCAAGTGAAGTGCCAATGT, R:TGAGGGCAGCTATATGGTCTC；ASCL2引物F:CGTGAAGCTGGTGAACTTGG, R:GGATGTACTCCACGGCTGAG；内参GAPDH引物F:CTGGGCTACACTGAGCACC, R:AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG。以cDNA作为模板，每个样品设置3个反应复孔，进行荧光定量PCR。反应条件:95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、60 ℃退火30 s 共40 个循环，分析各样品的Ct值 (threshold cvcle，循环阈值)，用2-ΔΔCt法分析各组实验数据。

3 免疫组织化学 收集手术切除的肺癌组织及远离肿瘤5cm以上的癌旁组织固定在4%的中性甲醛中，并包埋为蜡块，制成4μm切片，放置70℃烤箱2 h后，二甲苯浸泡脱蜡1 h，进行梯度酒精逐级水化，即依次在100%、95%、90%、85%、75%酒精中放置5min，双蒸水中放置30 min后置于pH6.0、0.01M枸橼酸钠溶液中高压锅煮沸3min进行抗原修复，滴加羊血清室温孵育1h，滴加一抗工作液(PLAGL2 2 μg/mL，ASCL2稀释比为1 ∶100)，4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次5min，二抗室温孵育30 min，PBS冲洗3次5min，DAB显色，苏木素复染，流水返蓝15min，依次在75%、85%、90%、95%、无水乙醇中进行脱水，二甲苯透明干燥后封片。

根据阳性细胞所占比例和染色程度进行免疫组化评分：根据阳性细胞所占比例计分，阳性细胞为棕黄色细胞，无阳性细胞计0分，<25%计1分；25%～50%计2分；50～75%计3分；>75%计4分；根据染色程度计分：深棕黄色计3分，棕黄色计2分浅棕黄色计1分，无阳性着色计0分。二者之和>3分为阳性表达，≤3分为阴性表达。

4 随访 对患者术后1～60个月进行定时随访，由专业随访人员采用电话及门诊的方式进行，患者死亡或者随访时间截止时结束随访。

三、统计学分析

结 果

一、 qRT-PCR检测肺癌组织中PLAGL2 mRNA和ASCL2 mRNA的表达水平

qRT-PCR检测PLAGL2 mRNA和ASCL2 mRNA在86例肺癌组织和癌旁组织中的表达情况。结果显示：PLAGL2 mRNA在肺癌组织中的表达(1.63±0.88)显著高于癌旁组织(1.08±0.70)(P<0.05)(图1A)，ASCL2 mRNA在肺癌组织中的表达(2.28±1.34)显著高于癌旁组织(0.99±0.56)(P<0.05)(图1B)。

二、 PLAGL2和ASCL2在肺癌组织中表达的相关性

Spearman等级相关分析法分析PLAGL2与ASCL2在肺癌组织中表达相关性，结果显示PLAGL2与ASCL2在肺癌组织表达呈正相关(rs=0.561，P=0.009﹚。(图2)。

A：PLAGL2 mRNA在肺癌组织中的表达显著上调；B：ASCL2 mRNA在肺癌组织中的表达显著上调。

三、免疫组化检测PLAGL2和ASCL2在肺癌组织中的表达情况

免疫组化检测PLAGL2、ASCL2在肺癌组织中阳性表达分别为50(58.14%)、58(67.44%)例，在癌旁组织中阳性表达分别为30例(34.88%)、26例(30.23%)，PLAGL2在肺癌组织中的阳性表达显著高于癌旁组织(χ2=9.348，P=0.002)、ASCL2在肺癌组织中的阳性表达显著高于癌旁组织(χ2=23.827，P<0.001)。

四、肺癌组织中PLAGL2和ASCL2表达临床意义

肺癌组织中PLAGL2的表达与患者的性别、年龄、组织类型、肿瘤大小及TNM分期均无关，差异无统计学意义(P>0.05)，而与组织学分级和淋巴结转移有关(P<0.05)。肺癌组织中ASCL2的表达水平与患者的性别、年龄、组织类型及肿瘤大小均无关，差异无统计学意义(P>0.05)，而与TNM分期、组织学分级及淋巴结转移有关(P<0.05)(见表1)。

五、肺癌组织中PLAGL2和ASCL2表达对患者预后的影响

对86例肺癌患者术后随访，研究PLAGL2和ASCL2表达对肺癌患者术后生存的影响，并按PLAGL2在肺癌组织中表达的染色程度和阳性细胞所占比例之和>5分为PLAGL2高表达组，≤5为分低表达组，ASCL2以同样的方法分为ASCL2高表达组和ASCL2低表达组。进行Kaplan-Meier生存分析，结果显示：PLAGL2高表达组患者的5年生存期明显短于PLAGL2低表达组(χ2=18.72， P?0.001)；同样，ASCL2高表达组患者的5年生存期也明显短于ASCL2低表达组(χ2=9.79，P<0.001)(图3)。

A:PLAGL2高表达组患者的5年生存期较短；B:ASCL2高表达组患者的5年生存期较短。

讨 论

肺癌严重威胁人类生命和健康[1]。近年来，由于社会的发展，引起人们生活节奏的加快、工作压力的增加、环境污染加重等不良因素，导致肺癌发病率增加及发病年龄的年轻化[13]。一方面肺癌发病率增加，另一方面肺癌早期症状不明显，使得肺癌患者确诊时往往已经为晚期，而晚期患者由于发生转移，致手术治疗受限，放化疗容易产生耐药及抵抗，最终导致肺癌预后不容乐观，是所有肿瘤相关死亡的主要原因[5,14]。然而，肺癌的发病机制尚未明确，研究报道促癌基因的激活和抑癌基因的失活是导致肿瘤发生、恶性进展的内在根源，针对癌基因和抑癌基因的靶向治疗对提高肺癌患者治疗和降低死亡率具有重要意义。

人类基因组中广泛存在锌指蛋白编码基因，锌指蛋白在正常生理过程及病理过程中均具有重要的作用[15]。其中PLAG基因家族编码的锌指蛋白，在其N末端具有7个保守的C2H2锌指结构域，可以结合DNA激活特定基因的转录，参与调控靶基因的功能，涉及多种肿瘤的恶性增殖进展过程[16-17]。PLAG锌指蛋白家族包括PLAGl、PLAGLl和PLAGL2，PLAGL2基因位于染色体20q11，属于核蛋白转录因子，PLAGL2最初在小鼠细胞系中发现，人类PLAGL2基因高表达于胎儿期[18]。Landrette等[19]首先研究PLAGL2与恶性肿瘤的关系，发现其过表达促进人类急性髓性白血病的发展，促使广大学者在肿瘤领域对PLAGL2进行研究，越来越多的研究表明PLAGL2是肿瘤致癌基因，在结直肠癌中PLAGL2在癌组织中的表达高于癌旁组织，其3'-UTR可促进结肠癌发生并可作为结肠癌治疗的新型潜在生物标志物[20]；在乳腺癌中，PLAGL2表达的降低抑制了乳腺癌细胞的增殖和转移[21]。而Yang等[8]报道在小鼠肺中诱导PLAGL2表达的雄性小鼠比雌性小鼠更容易发生肺癌，进一步在公共肺癌基因表达谱数据库分析发现在肺癌中具有PLAGL2高表达的患者更容易发现，且在疾病早期具有低PLAGL2表达的女性患者具有更好的预后。本实验qRT-PCR和免疫组化检测均发现PLAGL2在肺癌组织中的表达显著高于癌旁组织，其高表达与组织学分级和淋巴结转移相关，与瞿等[22]研究发现PLAGL2在前列腺癌组织中表达上调，且其高表达与包括肿瘤临床分期、淋巴结转移及包膜筋膜侵犯等在内的不良病理参数显著相关的结果具有相似性。同时本文Kaplan-Meier生存分析结果显示PLAGL2高表达患者预后较差，提示PLAGL2促进肺癌的发生发展，可能为患者不良预后和肺癌治疗的潜在指标。

ASCL2基因定位于染色体11p15.5，属于ASCL基因家族(ASCL1-ASCL5)中的一员，该家族含有基本螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域的转录因子，ASCL2是Wnt信号通路的下游靶标并通过与E-box结合而启动靶基因转录[23]。此外，ASCL2是肠隐窝基底柱细胞干性的主要调节因子，在胎盘的滋养层及大小肠的隐窝基底部表达丰富，而在其他正常组织中几乎不表达，其高表达导致大肠肿瘤疾病的发生[24]。近年来研究发现ASCL2在其他肿瘤中同样存在高表达，数据表明ASCL2的表达在原发性胃癌和胃转移性肿瘤中表达均增高，ASCL2促进EMT的发生，促进胃癌的转移[25]；ASCL2在骨肉瘤中表达升高，ASCL2阳性患者的总生存期和无转移生存期显著短于阴性表达患者，多变量Cox分析显示ASCL2表达为预测不良总体存活率和无转移生存率的独立预后因素，且ASCL2表达促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭[26]。Wang等[27]基于微阵列数据库分析发现ASCL2在乳腺癌、结肠癌、胃癌、肺癌、头颈癌和卵巢癌等肿瘤中表达较高。本实验发现肺癌组织中ASCL2的表达显著高于癌旁组织，其高表达与TNM分期、组织学分级及淋巴结转移相关，Kaplan-Meier生存分析结果显示ASCL2高表达者生存期较短，Hu等[12]研究发现与正常肺组织和肺腺癌相比，ASCL2在肺鳞癌中的表达增加，ASCL2高表达与TNM分期、肺鳞癌低分化和预后不良相关，与本文研究具有一致性，但是本文研究显示ASCL2在肺腺癌和肺鳞癌的表达没有差异，可能是由于样本数量及质量的原因。总之PLAGL2高表达可能参与并促进了肺癌的发生发展，可用于肺癌治疗和预后不良的新型生物标志物。

Wnt信号通路是调控肺癌恶性生物学行为的经典信号通路之一[11]。在结肠癌中PLAGL2通过激活wnt6a促进细胞增殖，还可以通过激活细胞核中Wnt信号通路重要组分β-catenin诱导EMT的发生促进细胞增殖[6]，而ASCL2是Wnt信号通路的重要靶基因，PLAGL2在肠上皮干细胞中可以直接增强ASCL2的表达[24]。PLAGL2和ASCL2是否发挥共同促进肺癌的发生发展，本研究结果显示PLAGL2和ASCL2在肺癌组织中的表达成正相关，表明两者可能具有协同关系，但是PLAGL2及ASCL2在肺癌中发挥作用的分子机制目前还不清楚，还需在体外及体内实验中进一步研究以得到更可靠的结论。

综上所述，PLAGL2及ASCL2在肺癌组织中均表达上调，并与肺癌患者预后差有关。PLAGL2和ASCL2在肺癌中的表达呈正相关性，可能具有协同作用， PLAGL2及ASCL2可能为肺癌患者预测预后及治疗的潜在基因靶点。