法舒地尔干预百草枯肺纤维形成机制的探究

刘丰进 孙斌 邱建清

百草枯理化性质

百草枯(PQ)属于一种季铵盐除草剂，可经消化道、呼吸道或破损的皮肤被人体不完全吸收导致中毒，其中口服是导致中毒的主要途径。经口进入体内的百草枯在胃肠道吸收率为5～15%，约2小时后达到其血浆浓度的峰值，并通过血液循环造成多器官不同程度的损伤，其中以肺脏损伤为著，这可能与肺脏II型肺泡上皮细胞有关[1]。未被吸收的百草枯以粪便、尿液、乳汁等形式排出，尿液是其排出的最主要方式。统计学分析发现在百草枯中毒大鼠模型中，其死亡率高达80%[2]。

百草枯中毒致肺纤维化形成机制

自百草枯问世以来，百草枯中毒导致肺纤维化的机制尚未阐明。目前认为其机制主要与氧化应激损伤，线粒体损伤，炎症反应有关。

一、氧化应激损伤

氧化应激损伤是百草枯中毒导致肺纤维化的重要启动机制[3]。百草枯具有较强的氧化性，在还原型辅酶II(NADPH)、一氧化氮合酶(NOS)等活性物质的作用下被还原成自由基PQ+，自由基PQ+迅速与氧结合转化为PQ2+和超氧阴离子(O2-)。O2-在超氧化物歧化酶(anti-oxidant enzymes，SOD)的催化作用下转化为过氧化氢(H2O2)，其在Fe2+的条件下可转变为活性更强的羟自由基，羟自由基可参与体内多种反应，形成活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，ROS使SOD活性降低，与构成细胞膜的主要成分-不饱和脂肪酸产生反应，生成大量的脂质过氧化物[4]，促使细胞凋亡，纤维细胞增生，导致肺纤维化。

二、线粒体损伤

线粒体是能量转换的双膜细胞器，在百草枯中毒致肺纤维过程中起到关键作用。百草枯进入人体细胞后利用相应载体介质和细胞膜的电位差穿过线粒体内膜进入线粒体，被复合物I或NADPH脱氢酶降解，快速与氧气反应生成过多的超氧化物。超氧化物通过脂质过氧化反应，导致线粒体结构破坏，同时也会导致线粒体的DNA损伤，使基因转录和蛋白表达异常[5]，加速了细胞坏死，促进肺纤维化。

三、炎症反应

百草枯中毒后产生的急性肺损伤，可迅速激活巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎性细胞在肺组织中聚集、浸润、活化。在百草枯诱导的大鼠急性肺损伤实验中，可发现中毒组大鼠炎性细胞较对照组明显增加[6]。活化的炎性细胞通过复杂的信号通路产生促肺纤维化的细胞因子，其中包括与各种纤维化密切相关的转化生长因子-β(TGF-β)。TGF-β在生物体中有3种不同形式的异构体，TGF-β1在其中起到重要作用[7]。它能够促进成纤维细胞不断分裂、增殖，也加快成纤维细胞转化为主要表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的肌成纤维细胞[8]，并激活通路下游的结缔组织生长因子(CTGF)[9]，诱导细胞外基质(ECM)大量产生。并通过多种信号通路协同其他促纤维化细胞因子的生成，如干扰素-γ( IFN- γ)、血小板衍生生长因子( PDGF)、α- 肿瘤坏死因子(TNF-α)等从而进一步导致肺纤维化的形成，加重肺损伤。

Rho/Rock信号通路

一、Rho/Rock信号通路构成

Rho /Rock信号通路是普遍存在于机体组织中可使多种细胞转变成纤维母细胞的信号通路，其中起决定性作用的信号分子有3种，分别是RhoGTP酶、Rock蛋白和肌球蛋白磷酸酶。

作为“分子开关”的RhoGTP酶，包含：Rho( A-C) 、Rac、Cdc42等，它们均属于小分子质量的G蛋白，控制多种细胞内信号转导途径。它的主要功能是使活性类型(GTP结合状态)和失活类型(GDP结合状态)二者间相互转换，同时还可启动并激活下游的激酶级联反应[10]。Rock蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其分子结构包括两个区域：氨基端催化结构域和羧基端pH结构域，它有两种类型：Rock1(ROKβ)和Rock2(ROKα)，二者在不同组织中广泛表达，Rock1mRNA主要表达在肺、肝、脾、肾和睾丸等器官中，Rock2mRNA在心脑等器官中高度表达，Rock1和Rock2具有极高的同源性，其氨基酸序列的同源性约为65%，激酶结构域的同源性约为94%。RhoGTP酶通过与Rock蛋白的Rho结合域(RBD)相互作用，使Rock蛋白活化从而改变其分子内“封闭”构象[11]。Rock蛋白作为该通路下游最主要的靶向效应分子，Rho传递信号刺激并活化Rock蛋白，使其下游产生一系列的磷酸化或去磷酸化反应。肌球蛋白磷酸酶是Rho/Rock 信号通路的下游标志物，其磷酸化水平增强反映了该通路处于高活化状态。Rho使Rock蛋白活化产生活化底物肌球蛋白磷酸酶，又使其磷酸化，进而参与了细胞的收缩、趋化、粘附、浸润、增殖、凋亡等各式各样的生物学行为[12]。

二、Rho/Rock信号通路与器官纤维化

1 Rho/Rock信号通路与心肝肾器官的纤维化

已有许多研究结果证实，Rho/Rock信号通路可能通过炎症损伤反应、调节细胞骨架、改变细胞结构、刺激上皮细胞间质分化等方式，参与到多种器官纤维化的产生和发展，如：心脏纤维化、肾纤维化、肝纤维化等，因此可以推断Rho/Rock信号通路参与多器官纤维化的形成。

2 Rho/Rock信号通路与肺纤维化

有研究表明，Rho/Rock 信号通路与肺组织氧化应激反应关系密切，而氧化应激损伤是肺纤维化形成的首发机制。部分研究指出阻断Rho /Rock信号通路能够减轻氧化应激损伤，进一步体现了该通路参与到氧化应激反应的过程中，通过阻碍肺氧化应激反应的发生，进而干预肺纤维化的形成[10]。李贵芝等[13]等动物实验阐明，抑制Rho/Rock 信号通路可以减轻氧化应激反应，减少活性氧簇的生成，从而提高超氧化物歧化酶的活性，减轻或阻碍肺纤维的产生和发展。Wang等[14]通过用法舒地尔治疗急性肺损伤的Wistar大鼠，Rho和Rock1的表达显著下调，超氧化物歧化酶活性增加，肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位在肺组织中的磷酸化水平明显降低。张丽娟等[15]研究结果显示，Rho/Rock信号通路导致矽肺纤维化的过程中有TGF-β，α-SMA、PDGF等多种细胞因子的参与，但具体机制要进一步探讨，抑制Rho/Rock信号通路可以减少相关促纤维化细胞因子的生成进一步影响肺纤维化的产生。Bei等[16]学者通过次氯酸诱导的系统性硬化症致肺纤维化的雌性C57BL/6鼠，观察到应用法舒地尔的实验组炎性细胞、肺纤维化水平降低，不仅活性氧簇降低且α-平滑激动蛋白合成也相应减少。而高艳阐述的观点[17]进一步论证了Rho/ROCK信号通路参与肺纤维化产生和发展的过程中，多种致肺纤维化细胞因子，如TGF-β、CTGF、α-SMA等，均与该通路有密切联系。

法舒地尔

一、法舒地尔的药理作用

法舒地尔(Fasudil)作为一种新型高效5-异喹啉磺胺衍生物，于上个世纪末由日本旭化成株式会社联合名古屋大学共同研制发明，同时在日本被批准可应用于临床治疗。2001年8月经我国注册批准后允许进口使用。作为唯一应用于临床的Rho/Rock信号通路激酶抑制剂，法舒地尔主要在Rho激酶催化区的ATP结合位点与ATP产生竞争从而抑制Rho激酶的生物活性[18]，减少肌球蛋白轻链磷酸酶的磷酸化水平，增加其活性，减少炎性因子的生成，拮抗Ca2+,使内皮细胞的张力下降，扩张血管，达到改善血流动力学的目的，从而预防缺血再灌注损伤，提高组织的微循环，保护神经和细胞，减少细胞的凋亡，也可以减少脂质的沉积起到缓解血管粥样硬化的作用[13]。当前法舒地尔作为有效的血管扩张药物，主要应用于一些脑缺血性疾病的防治，例如蛛网膜下腔出血的脑血管痉挛、慢性缺血性脑血管痉挛等。随着对法舒地尔不断深入的研究，众多研究成果表明，法舒地尔的临床应用不仅仅局限于脑血管疾病，也可减轻多脏器损伤、缓解并改善肺脏、肝脏、心脏、肾脏纤维化的程度。

二、法舒地尔干预百草枯肺纤维化

Zhang等[19]大鼠动物实验结果表明，腹腔注射法舒地尔的百草枯中毒大鼠，Rho、Rock蛋白表达水平、氧化应激损伤水平明显降低，肺组织病理提示实验组较对照组炎性细胞数量显著减少，实验组肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子、白介素等相关因子含量较对照组明显减少。同时该实验结果也得出，高浓度法舒地尔干预组较低浓度法舒地尔干预组对于百草枯中毒大鼠的肺损伤具有更为显著的保护作用，但仍需扩大样本量进一步论证。周挺等[20]动物实验研究显示，用法舒地尔干预的百草枯中毒大鼠，TGF-β1mRNA及其蛋白的表达较百草枯中毒组大鼠明显下降，进一步证实了法舒地尔通过阻断Rho/Rock激酶信号通路减少TGF-β1促纤维化因子的产生，从而减轻肺纤维化的程度。何旭娟[21]等研究结果表明，法舒地尔可降低百草枯中毒大鼠肺纤维化中α-SMA的含量，前期可减轻百草枯导致的急性肺损伤，同时影响后期百草枯肺纤维化的形成。方建江等[22]实验结果再次论证了，通过RealtimePCR、Western-blot测定CTGF、Rock1mRNA和蛋白的表达，进一步证实了法舒地尔通过干预Rho/Rock信号通路，减少百草枯中毒大鼠CTGF含量，缓解大鼠肺纤维化程度。夏菁等学者[23]为评价Rho激酶抑制剂干预百草枯中毒SD大鼠的效果，通过观察肺的形态学、测定CTGF和TGF-β1蛋白表达，得出Rho激酶抑制可抑制TGF-β1和CTGF蛋白的表达，提示Rho激酶抑制剂对百草枯中毒大鼠肺纤维化的治疗有潜在价值。综上所述，法舒地尔通过抑制Rho/Rock信号通路，干预百草枯肺纤维化形成的多种机制，从而影响晚期肺纤维化。

结 论

现国家已经明令禁止生产百草枯水剂，但由于库存量大及其他剂型的生产，各地区急诊科仍会接诊大量百草枯的中毒患者，其中大部分患者死于急性肺损伤及晚期肺纤维化所致的呼吸衰竭。目前，百草枯中毒尚无明确有用的治愈方法，临床上以抗氧化和抗炎的传统治疗为主[24]。现大量研究表明Rho/Rock信号通路与多器官纤维化产生有密切关系，法舒地尔在抑制器官纤维化的产生和发展过程中起到了有效作用，更为百草枯肺纤维化的临床治疗提供了一个新的思路和治疗手段。