生物传感器在谷物安全品质检测上的应用与研究进展

徐仁庆，李建飞，陆松花，郁 霖

(1.苏州技师学院，江苏 苏州 215000； 2.佐竹机械(苏州)有限公司，江苏 苏州 215000)

谷物作为人类食物与鱼禽畜饲料的重要来源，从种植管理到储藏及加工的各个环节，其安全品质不可避免的会受到各种不利因素的影响，如环境污染因素、农药与化肥滥施因素、粮食的储存不当因素等。如今，谷物的品质安全早已成为全人类所面临的共同问题。我国作为产粮大国，谷物的品质安全问题更是不容忽视。相关报道指出，当前我国谷物的品质安全隐患重点存在于以下3个方面：一是真菌污染率高且污染情况复杂；二是一些污灌区或矿区较为突出的重金属超标问题；三是种植与管理过程中的农药残留问题[1]。近些年来的谷物安全相关调查结果也反映出，国内谷物及其制品的安全问题不容乐观。如宫春波等在2014-2017年间对烟台市市售4类225种谷物及其制品进行随机抽样，检测得出玉米、小麦及其制品真菌毒素污染情况普遍存在，且检出率均达到50%以上(55.2%与53.85%)[2]。许嘉等对北京市市售谷物制品进行真菌毒素与重金属检测发现，大米、小麦粉、玉米、玉米面均受到不同程度的真菌毒素污染[3]；玉米面与小麦粉受到不同程度的镉污染和铅污染[4]。杨柳等[5]对河北省的鸡类饲料原料进行重金属分析，结果表明绝大部分饲料原料中镉超标；谷物及其多数加工制品、膨化大豆和棉籽粕中铅超标；小部分饲料的镉与砷超标。吴雨珊等[6]对国内奶牛饲料进行调查分析显示，敌敌畏和氟氯氰菊酯在玉米饲料中的检出率均达到100%，溴氰菊酯在玉米饲料和精料补充料中的检出率均超过80%。目前，国内对于谷物及其制品的安全品质指标检测多采用色谱法及色谱与质谱联用法等，该类方法虽然较为权威，但由于设备价格与设备维护费用昂贵，且对操作人员的专业能力要求高，因此具有很大局限性。近些年来，为满足市场对于低成本与快速检测的需求，生物传感器作为农产品安全品质快速检测的新型技术得到了快速发展。

1 生物传感器概述

生物传感器是一种结合了生物识别机制和物理转导技术的分子传感器[7]。其工作原理是待测物质经扩散作用进入分子识别元件(生物活性材料)，经分子识别作用与分子识别元件特异性结合，发生生化反应，所产生的生物学信息通过相应信号转换元件转换为可以定量处理的光信号或电信号，最后经电子测量仪的放大、处理与输出，即可实现对待测物质浓度进行检测分析的目的[8]。按照生物活性材料的种类进行划分，可分为微生物型传感器、免疫型传感器、酶传感器、细胞传感器、组织传感器及DNA传感器等。按照信号转换元件的不同进行划分，又可分为电化学生物传感器、介体生物传感器、光学型生物传感器、半导体生物传感器、量热型生物传感器、压电晶体生物传感器等[9]。在农产品安全品质检测方面，生物传感器以其检测速度快、灵敏度较高、特异性强、价格较为低廉等优点一直备受研究者的关注。

2 生物传感器在谷物安全品质检测上的应用

2.1 真菌毒素

真菌毒素是由真菌产生的具有毒性的次生代谢物，可对农作物、食品及饲料等植物性产品造成广泛污染[10]。尤其是在谷物的长期储藏期间，不当的储存条件可加速真菌的滋长与繁殖，促使真菌毒素的不断富集。国家标准《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)对于谷物中真菌毒素的检测项目主要包括黄曲霉毒素B1(AFB1)、脱氧雪肤镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素A(OTA)，以及玉米赤霉烯酮(ZEA)四大类。以上谷物真菌毒素的摄入可引起不同程度的急性或慢性中毒，如AFB1可引发恶性营养不良、急性肝炎、肝硬化、肝癌，以及雷氏症候群等病症，被国际癌症研究所认定为最强基因毒性剂；DON又称为呕吐毒素，可引起呕吐、胃肠炎、免疫抑制和血液病等；OTA可对人体肾脏及免疫系统造成损害，并有潜在的致畸、致癌危害；ZEA则会引发雌激素综合症等。

目前，国内外在谷物真菌毒素检测用生物传感器的研究上多集中在酶传感器、免疫传感器及新型材料方面。其中在AFB1的检测应用上，Chrouda等[11]以AFB1对乙酰胆碱酯酶(AChE)的抑制作用为基础，并以海藻酸钠生物聚合物作为固定化乙酰胆碱酯酶的新基质制备了电化学生物传感器；在0.1～100 ng/ml线性动态范围内，检测下限为0.1 ng/ml，低于AFB1(2 μg/L)的推荐水平，具有较高的灵敏度、良好的重复性和长期储存稳定性；同时用添加AFB1(0.5 ng/ml)的大米样品评价了该方法的适用性。Bhardwaj等[12]使用纳米颗粒集成金芯片开发了一种无标记的超敏感微流表面等离子体共振生物传感器用于检测AFB1，其线性测定范围在1～50 nm，检测限为0.19 nm；通过加标的小麦样品评估了所提出的生物传感器的有效性，其平均回收率(93%和90.1%)是可以接受的。Díaz Nieto等[13]基于由大豆过氧化物酶和化学还原的氧化石墨烯复合物修饰的玻璃碳电极，通过基于响应面方法的实验设计，获得了构建生物传感器的最佳条件，进而开发了第三代酶生物传感器，对掺有曲霉素的玉米样品进行分析，平均回收率为96.5%。花荣[14]通过引入电位分辨比率原理，配合笔记本电脑与微型电化学工作站，开发出了可以在阳光照射下即可工作的新型光电化学生物传感平台，并成功应用于AFB1的检测，就此消除了阳光强度随时间和气候而变化所引起的干扰。

在DON的检测应用上，Schnerr等[15]基于表面等离振子共振(SPR)的间接抑制性免疫分析方法，合成DON-生物素偶联物，并将其固定在链霉亲和素包被的SPR传感器表面，以测量添加到小麦样品中的游离抗DON抗体，分析显示，使用新型生物传感器与气相色谱/质谱及高效液相色谱法测得的DON浓度之间呈线性正相关，其相关系数分别为0.946 4与0.906 6。Ong等[16]以铁纳米花-石墨烯-镍(INFGN)为传感器，特异性适体为生物识别元件，研制了一种选择性生物传感系统，其对DON的检测限为2.11 pg/ml，且48 h后仍保持30.65%的活性，具有很高的稳定性。Zheng等[17]基于表面活性剂辅助合成TiO2介晶的双功能试剂调节比例电化学发光生物传感器，通过发光氨和缓冲液(4,4'-二羧酸-2,2'-联吡啶基)的两个电化学发光信号比来检测DON，检测范围为0.05～5 ng/ml，检测限为1.67×10-2pg/ml。韩逸陶等[18]基于无模板合成鸟嘌呤四聚体(G-quadruplex,G4)方法，以及G4与特异性染料分子结合后的荧光增强效用，并利用DON与其适体DNA的高亲和作用以及核酸外切酶的酶切反应，构建了可快速分析谷物中DON的荧光“开启”的生物传感器。其在用于添加DON的小麦和玉米样品实验中，回收率为94%～112%，相对标准偏差为3.4%～4.9%。

在OTA的检测应用上，Rubaye等[19]首次报道了适体作为OTA的高度特异性人工分子受体与全内反射椭圆偏振法(TIRE)的结合使用；研究结果表明，用特异适体直接检测OTA的浓度可降至0.01 ng/ml；通过动态TIRE光谱测量研究了适配体/OTA结合的动力学，其可评估的亲和力常数KD=1.8×10-8mol/L，这是高度特异性适配体/OTA结合的特征。张立转等[20]基于聚多巴胺纳米颗粒荧光猝灭效率高，以及核酸适配体特异性的识别能力特点，构建了一种用于OTA定量检测的快速、灵敏、简便且经济实用的荧光生物传感器，其检出限为20 nmol/L。Kim等[21]基于金纳米材料，并将其部分嵌入固体基质(如聚二甲基硅氧烷)，开发了一种固态单步适配传感器，其线性范围为0.1～1 000 ng/ml，检测限为0.022 ng/ml(在30 min内到达OTA)，此外通过3次循环检测与回收的可重复使用性评估确定了其很好的可重复使用性；该项研究为便携式、可重复使用的现场检测用生物传感器平台的开发奠定了基础。Hao等[22]开发出一个便携式太阳能驱动的可视化的电化学生物传感器，该传感器被制造在一个小的ITO电极上，该电极分为检测模块与参考模块两部分；每个模块由两个区域组成，其中三维石墨烯水凝胶纳米复合材料用于构建光电感应区域，电致变色材料普鲁士蓝用于可见区域；通过两个模块上可视区域的色度比率进行量化，获得了良好的线性范围(1～500 ng/ml)，检出限为0.29 ng/ml。

在ZEA的检测应用上，Azri等[23]采用半胱胺盐酸盐和1,4-亚苯基二异氰酸酯键合，用ZEA修饰金电极，将解离常数为(13.4±2.1)nm的截短型ZEA适体应用于适配传感器。该传感器与其他ZEA类似物有高度的交叉反应，而对其他真菌毒素无交叉反应；其检测范围在0.01～1 000 ng/ml，检测限为0.017 ng/ml；用于玉米籽粒提取物中玉米醇溶蛋白的ZEA测定，回收率为87%～110%。Moradi等[24]使用电纺丝技术制造了一种掺入聚丙烯腈/纳米纤维改性的笔形石墨电极，以应用于食品模拟物中，尤其是液态食品，用以检测ZEA。该传感器是在室温下使用pH6的Britton-Robinson缓冲液制成，对ZEA在5～30和60～100 nmol/L的浓度范围内具有线性行为和良好特性。Wu等[25]将合成的高荧光上转换纳米粒子与ZEA适体互补寡核苷酸偶联作为信号探针，并将ZEA适体固定化的磁性纳米粒子作为捕获探针，结果表明，在0.05～100 μg/L范围内，其检测限(玉米0.126 μg/kg，啤酒0.007 μg/L)明显低于现有方法；通过将实际食品样品中的测定结果与商业方法检测结果进行比较，验证了竞争免疫分析法的可靠性。Sadrabadi等[26]研究表明使用双链DNA/多壁碳纳米管-聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰的笔形石墨电极，可通过检测ZEA与双链DNA的相互作用测定低至0.005 ng/ml的痕量ZEA。

2.2 农药残留

为防治病、虫、草害，保障谷物长势与产量，各类杀菌剂、杀虫剂、除草剂、激素类药剂等的施用已贯穿于谷物萌芽到植株生长的整个生命周期中，且以杀虫剂的使用最为频繁。其中有机磷杀虫剂以其广谱、高效、价格较低的特点被广泛使用于植保管理中，但是其高毒性与高残留的特点也给谷物及其制品的安全问题带来巨大隐患。目前，在有机磷农药的检测上，我国标准《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》(GB 2763—2019)对植物源性食品中90种有机磷农药及其代谢物残留量的测定作出了具体说明，测定方法为气相色谱法。在生物传感器研究应用上，基于有机磷对乙酰胆碱酶活性的抑制作用，以及乙酰胆碱酯酶酶抑制生物传感器可避开大量的预处理的特点，使之为样品中有机磷农药痕量残留的快速检测提供了可能性[27]。如高慧丽等[28]所制备的乙酰胆碱酯酶生物传感器，采用溶胶-凝胶法在醋酸纤维膜上将酶固定，然后将该酶膜在聚四氨基钴酞菁修饰的玻碳电极上进行固定，再采用计时安培法对对硫磷、辛硫磷与氧化乐果进行测定，其检测限依次为2.0×10-9mol/L、1.4×10-9mol/L和1.1×10-8mol/L。薛瑞等[29]采用层层自组装技术并通过静电引力把乙酰胆碱酶与金纳米粒子固定到玻碳电极表面，所制备的酶传感器对不同浓度甲基对硫磷进行检测，检出限为7.6×10-6mol/L。Zhang等[30]通过聚合4,7-二(呋喃-2-基)苯并噻二唑与Ag-rGO-NH2的协同作用，开发了基于共轭聚合物和Ag-rGO-NH2纳米复合材料的高灵敏度安培乙酰胆碱酯酶生物传感器。在优化后的传导条件下，马拉硫磷的检出限约为0.032 μg/L，敌百虫的检出限约为0.001 μg/L。关桦楠等[31]以多层纳米酶膜修饰电极为核心，采用脂质体技术制备乙酰胆碱酯酶的微反应器，并以微反应器、壳聚糖及二氧化硅为基质，构建了有机磷农药残留快速检测酶电化学生物传感器，其对敌敌畏的最低检出限为(0.72±0.065)μg/L，且灵敏度高、重复性与选择性好。卫银银等[32]研究报道了二氧化铅或二氧化钛修饰的乙酰胆碱酶生物传感器具有光电协同催化功能；且乙酰胆碱酶表现出良好的动力学反应，其对敌百虫的最低检出限达到1.0 nmol/L。Nagabooshanam等[33]在10～120 ng/L的浓度范围内，研究了基于聚苯胺和羧基官能化的多壁碳纳米管的超灵敏电化学传感器在检测实际样品中有机磷酸盐的效果，结果表明毒死蜱的灵敏度为0.41 mA·(ng/L)-1·cm-2，检出限为8.8 ng/L；对甲基对硫磷的灵敏度为0.58 mA·(ng/L)-1·cm-2，检出限为10.2 ng/L。

2.3 重金属

谷物在种植管理过程中，重金属离子可通过水、药、肥等多种途径被谷物植株吸收。虽然最终到达并存在于谷物籽粒中的重金属含量极小，但这些痕量重金属可通过食物链直接或间接的在人体内不断富集；一旦超过人体耐受限度，将会引起急性、亚急性或慢性中毒，危害人体健康。因而重金属检测对于保障谷物及其制品的安全品质必不可少。我国最新标准《食品安全国家标准 食品中污染物限量》(GB 2762—2017)对于谷物中重金属的检测项目主要包括铅、镉、汞、砷、铬5种。在检测方法上，常规方法测定步骤主要包括样品的消解处理(如压力罐消解、回流消解、微波消解、湿式消解、干式灰化等)与质谱或光谱分析(包括冷原子吸收光谱法、原子吸收光谱法、原子荧光光谱法，以及电感耦合等离子质谱法等)[34]。在快速检测技术的研究与应用上，基于免疫学检测技术的试剂条与试剂盒产品，因其成本较低、特异性强、可用于现场检测、且对操作人员的专业要求不高等优点，在谷物等农产品的重金属检测上得到较高推广。其次，X射线荧光类设备因其无需消解、无需试剂耗材、检测速度快、操作简单、检测范围广、灵敏度高和检出限低等优点也备受关注；但由于该类型设备开发技术难度高，致使国内市场上可见到的X射线荧光类谷物重金属检测仪厂商也只有寥寥几家，如江苏天瑞、钢研纳克，以及美国三值，且市场价格也十分高昂，在推广使用上具有很大局限性。而有关生物传感器在食品重金属检测方面的研究仅有少量报道，如杨文平等以磁性Fe3O4纳米粒子的过氧化物酶活性作为传感信号输出工具，并以核酸适配体的特异性识别功能作为靶标识别元件，开发了一种可简单快速检测Cd离子与Pb离子的比色传感器[35]。

3 小结与展望

目前，国内外对于生物传感器在谷物安全品质的快速检测应用上，多集中在真菌毒素与农药残留方面，而在重金属检测方面的研究较少，且相应检测设备在实际应用中也均存在着诸多方面的局限性，如检测灵敏度、检测稳定性、检测便利性等。但生物传感器技术作为一种涵盖生物化学、物理学、电子学以及材料学等多学科融合技术，随着各学科技术与多学科融合技术研究的不断发展，其在谷物安全品质快速检测应用方面的诸多局限性也必将一一打破。此外，为满足不同谷物流通过程中不同环节的检测要求，谷物用生物传感器设备也必将从单一化到多样化，从普适性到针对性方向发展。