结直肠癌Visfatin、MMP-14的表达及意义

荣玮 徐晨 李雪松 刘婷 于秀文

(齐齐哈尔医学院病理学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

随着人们生活水平的提高及相应生活方式的改变，结直肠癌(CRC)的发病率逐步增加。而在CRC的发病危险因素中，肥胖具有明显的独立性〔1〕。内脂素(visfatin)是新近发现的一种脂肪细胞因子具有类胰岛素作用、促炎、促进脂肪组织分化和合成等多种生物学活性，血浆水平升高是中国患者早期和晚期CRC的一个重要危险因素〔2〕。基质金属蛋白酶(MMP)-14是MMPs家族第一个被发现的膜型MMP，是影响肿瘤细胞转移及肿瘤进展的重要蛋白酶〔3〕。visfatin、MMP-14通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)途径，参与肺癌细胞生长、转移及血管生成等病理生理过程〔4～6〕，二者在CRC组织中是否存在相互关联尚待证实。本研究应用RT-qPCR技术和免疫组化技术检测 visfatin、MMP-14在CRC组织中不同水平的表达，将二者与CRC临床病理因素的关系和相关性进行分析，从而探讨其在CRC侵袭、转移中的作用，为CRC的诊断和靶向治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1标本来源 2015～2017年齐齐哈尔医学院附属医院根治性切除术的CRC原发病例64例患者的新鲜手术切除标本为观察组，术前均未经任何系统的放疗和化疗。对照组为对应远切端正常组织64例〔距癌边缘>5 cm，后经苏木素-伊红(HE)证实无癌组织浸润〕。在不影响正常临床病理检验的前提下立即在无菌操作下一次取材适量的新鲜疑似癌组织标本，并标记好患者信息，在肉眼观典型病变位置取10 mg放入RNase Free EP管内，30 min内放入-80℃超低温冰箱冷冻储存，剩余部分10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，HE染色证实均为CRC，与临床病理诊断相符。男44例，女20例；发病年龄60岁以下的27例，60岁以上含60岁37例；发生部位结肠24例，直肠40例；肿瘤最大直径<5 cm 31例，≥5 cm 33例；根据结直肠肠腺癌的组织学形态及分化程度可分为：高中分化36例，低分化28例；浸润<肌层27例，浸润≥肌层37例；无淋巴结转移者23例，有淋巴结转移者41例; TNM分期中Ⅰ期7例，Ⅱ期17例，Ⅲ期36例，Ⅳ期4例。

1.2主要试剂 TAKARA公司PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒及TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus) RT-PCR试剂盒分别进行反转录和目的片段的扩增。visfatin正义链5′-TGCCTTCGGTTCTGGTGGAGGTT-3′;visfatin反义链5′-ACAAAATTCCCTGCTGGCGTCCT-3′ ;MMP-14正义链5′-GGAACCGTGTAGCTTTGTGTCTGTC-3′；MMP-14反义链5′-TGAGGGTCCTGCCTTCAAGTG-3′；GAPDH正义链5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；GAPDH反义链5′-GAGATGGTGATGGGATTTC-3′；鼠抗人visfatin 、MMP-14多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，工作液浓度为1∶600，免疫组织化学试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色液为福州迈新生物技术公司产品。

1.3实验方法

1.3.1RT-qPCR检测 取-80℃保存的新鲜组织标本按Trizol试剂盒说明抽提组织总RNA，紫外分光光度法评估RNA的纯度，A260/A280 的比值在1.8～2.1，总RNA样品置-80℃保存备用。按照cDNA 反转录反应试剂盒说明书进行反转录来获得所需cDNA置-80℃保存待检。按 RT-qPCR试剂盒的操作步骤，进行 PCR 的扩增反应，PCR反应液在冰上进行配制，反应的体系20 μl，测定visfatin mRNA和MMP-14 mRNA的表达，GAPDH 作为内参，根据各目的基因的 CT 值，用 2-ΔΔCt法比较CT值。

1.3.2免疫组织化学法 切片常规脱蜡，水化后，3%过氧化氢(H2O2)-甲醇封闭内源性过氧化物酶20 min，枸橼酸高压修复10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3×3 min，一抗4℃冰箱过夜，第2天切片恢复室温后，依次滴加试剂A：反应增强液，试剂B：酶标抗小鼠/兔IgG聚合物，室温各孵育15 min，中间PBS洗3×3 min，DAB显色，苏木素复染。以PBS代替一抗作阴性对照。采用半定量积分法判定结果，显色度按细胞着色深浅计分：0分基本无着色;1分浅黄;2分浅棕，3分深棕。根据阳性细胞所占百分比计分，无阳性细胞为0分;阳性细胞<10%为1分;阳性细胞10%～50%为2分;阳性细胞51%～75%为3分;阳性细胞>75%以上为4分。

1.4统计学方法 使用SPSS25.0 软件进行t检验、χ2检验、Spearman等级相关分析。

2 结 果

2.1visfatin mRNA和MMP-14 mRNA的表达情况 visfatin mRNA在观察组和对照组中的相对表达水平分别为4.315 3±2.478 51和1.010 0±0.891 55，两组间差异有显著性意义(P<0.01)。MMP-14 mRNA在观察组和对照组中的相对表达水平分别为3.937 2±2.482 67和0.911 2±0.938 74，两组间差异有显著性意义(P<0.01)。

2.2visfatin mRNA和MMP-14 mRNA表达的相关性分析 visfatin mRNA和MMP-14 mRNA呈显著正相关(r=0.758，P<0.01)。见图1。

2.3visfatin和MMP-14 免疫组化的表达情况 visfatin免疫组化阳性产物呈棕褐色颗粒状位于细胞核和细胞质。visfatin在对照组、观察组的阳性率分别为29.7%(19/64)、67.2%(43/64)，两组比较具有统计学意义(P<0.001)。MMP-14免疫组织化学阳性产物呈棕褐色颗粒状位于细胞膜和细胞质，在正常肠黏膜不表达或表达较弱，在癌组织和间质中弥漫分布强表达或仅在间质强表达，见图2。MMP-14在对照组和观察组的阳性率分别为17.2%(11/64)、62.5%(40/64)，两组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

图2 免疫组化检测两组visfatin、MMP-14表达(×200)

2.4visfatin与MMP-14表达与结直肠癌的临床病理因素的关系 visfatin和MMP-14的表达与患者年龄、性别和肿瘤部位、大小无相关性，与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关(P<0.05)。见表1。

表1 结直肠癌患者visfatin与MMP-14表达与临床病理因素的关系(n)

2.5visfatin与MMP-14在结直肠癌组织中表达的相关性 visfatin和MMP-14在结直肠癌组织中的表达呈显著正相关(P<0.01)，见表2。

表2 visfatin与MMP-14在结直肠癌组织中表达的相关性

3 讨 论

近年来研究发现，脂肪组织不再只是一种沉默的能量储存器官，仅用来评估人体营养状况，也是一种很重要的内分泌器官，分泌多种具有活跃生物学活性的物质，如visfatin、瘦素、脂联素、抵抗素等，这些物质统称作脂肪细胞因子。visfatin与烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)、前B细胞集落增强因子(PBEF)具有相同结构的同一蛋白质分子。人类该相关基因位于第7号染色体，长约37.41 kb，含11个外显子和10个内含子，可编码473个氨基酸，是一类具有类胰岛素作用、促炎、促进脂肪组织分化和合成等多种生物学活性的脂肪细胞因子，广泛表达于体内多种组织器官。visfatin在胃癌的研究〔7〕显示，抵抗素和visfatin协同促进胃癌细胞的生长。乳腺癌组织visfatin、淋巴结转移、肿瘤分期、年龄和肿瘤大小，被确定为高度相互作用并与乳腺癌进展相关。子宫内膜癌高visfatin血清水平预测子宫内膜癌患者预后差。visfatin水平上升与CRC发病风险相关，与疾病恶化程度和肿瘤分期也有关〔8～10〕。

MMP-14基因组定位于14q11，全长大于10 kb，由10个外显子和9个内含子组成，编码582个氨基酸。MMP-14可以通过激活MMP-2、MMP-9、MMP-13等，降解肿瘤细胞周围的间质成分，还可以直接降解肿瘤间质中的如玻璃黏连蛋白、层黏连蛋白-1、和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等成分，涉及到多种生物的细胞外基质的降解过程和加速血管生成，被认为是影响肿瘤细胞转移及肿瘤进展的重要蛋白酶。MMP-14在肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤中表达的量和强度均上调，并和恶性肿瘤的临床 TNM 分期、病理分化程度、淋巴结转移关系密切〔11，12〕。

本研究通过基因水平和蛋白水平证实visfatin和MMP-14在CRC中高表达，且与CRC的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期有关。说明二者在CRC的侵袭、转移中发挥重要作用。Adya等〔13〕发现visfatin能促进内皮细胞表达、MMP-2，MMP-9增多，导致内皮功能紊乱和新生血管的形成。MMP-14在对MMP-2进行有效活化的同时又反作用于 MMP-14，使 MMP-14表达明显增高，形成环式循环，进而促进肿瘤离开原发部位发生转移〔14，15〕，此种作用使肿瘤转移潜能大大增加。PI3K/Akt通路具有激活MMP-14和MMP-2促进肿瘤血管生成拟态，visfatin通过AKT/PI3K和细胞外信号调节激酶(ERK)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活诱导乳腺癌细胞增殖，并对细胞凋亡具有保护作用〔4〕。骨关节炎患者其visfatin浓度较高，且与Ⅱ型胶原蛋白的降解产物呈正相关，表明visfatin参与软骨基质的降解，其中重要一点是visfatin促进软骨细胞表达MMP-14降解软骨基质Ⅱ型胶原所需酶类〔16〕。综上所述，visfatin与MMP-14功能上相互影响，但目前还没有在CRC组织中关于二者相关性的报道。本研究在基因水平和蛋白水平还研究了二者的相关性，发现二者在结直肠癌存在明显的相关性，visfatin的上调影响MMP-14的表达。上述关于二者相互作用的机制是否存在于CRC中尚待研究。二者参与机体多种生理和病理进程，在肿瘤、心血管疾病、炎症相关疾病、中枢神经系统疾病和骨关节疾病中的作用已受到重视。进一步深入了解二者的相互关系及相互作用机制将有助于疾病的诊断和靶向药物的研究，具有一定的医学价值。