应用MIR预测牛健康状况的研究进展

陈焱森，上官爱哨，陈明新，马亚宾，李春芳，徐为民，程春宝，熊琪，张淑君

（1.华中农业大学、动物遗传育种与繁殖教育部实验室，武汉 430070; 2.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所、动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064; 3.河北省畜牧良种工作站、河北省牛种质资源技术创新中心，石家庄 050061；4.湖北省畜禽育种中心DHI测定实验室，武汉 430070）

抗病育种为牛抵抗疾病提供了一种新途径，但疾病性状数据收集需要花费巨大的人力与资金，导致很难得到大规模的相关数据进行遗传评估，并且人工记录数据存在不准确问题，会影响遗传评估的准确性。科研人员一般通过检查牛血液或牛奶中生物标记物来确定牛的亚临床疾病。在国外（如比利时、荷兰和美国等）研究人员基于中红外光谱（MIR）开发了便于大规模检测的预测模型。目前，先使用MIR预测与疾病相关的生物标记物，再对牛健康状况进行判断是主要方法[1,2]，另外也可以直接使用MIR对牛健康状况进行判别[3]。此外，最近还有研究将两者相结合进行判别[4,5]。

酮病主要是因为牛在产后能量摄入不足，造成体内能量负平衡，导致牛的脂肪与蛋白被动员，使体内酮体累加[6]。其会对牛的产奶量和繁殖性能产生负面影响[7]，还会增加后续疾病的风险，例如皱胃偏移[8]。研究证实的酮病与亚临床酮病生物标记物有：丙酮（Acetone, Ac）、β-羟丁酸（β-hydroxybutyrate, BHBA）[9,10]，并且有研究表明亚临床酮病患牛产后几周血液中的非酯化脂肪酸（NEDA）、葡萄糖和钙的浓度都与健康牛差异显著[11～13]。自2012年以来，奶牛酮病已经成为荷兰牛奶记录计划中常规检查项目之一[14]。

机体能量平衡被打破时，会增加牛发生生产疾病（临床或亚临床）、减少生产量和降低繁殖率的风险[15]。然而，由于缺乏快速、简便和廉价的能量平衡测量方式，阻碍了其被纳入日常管理决策或育种计划[16]。哺乳期奶牛身体能量状态特征包括能量平衡和能量值，并且还包括能量摄入的相关特征[17]。能量平衡（Energy balance, EB）计算可为牛奶中的能量摄入和输出差以及维持（使用体重预测维持）提供参考[18]，并且有研究表明，柠檬酸在牛能量负平衡期间的变化最大[19]。

鉴于国外已经在相关领域进行了一些研究，并且部分国家已经应用到奶牛遗传育种中，本文现对其进行总结，以期为我国科研工作者开展相关工作提供借鉴。

1 MIR预测奶牛酮病的研究

Hansen首次报道了基于MIR检测奶牛酮病的方法，该方法使用多元校正法建立了预测牛奶中Ac的模型，其在预测集中的决定系数（Coefficient of determination, R2）与均方根误差（RMSE）分别为0.81和0.27mmol/L，可将奶牛分为健康和可能患酮病牛（牛奶丙酮阈值为0.9mmol/L），但模型只能基于牛奶中自然含有的丙酮进行模型建立，人为添加的不行[20]。

Heuer等采用偏最小二乘回归法（Partial least square regression, PLS）建立了基于MIR的预测牛奶中Ac浓度的模型，首先选出MIR的1450cm-1～1200cm-1波段并进行二阶导数预测处理，交叉验证误差为0.21mmol/L；当亚临床酮病的阈值为0.4～1.0mmol/L时，通过预测丙酮浓度来判断奶牛是否患有亚临床酮病，其灵敏度为95%～100%，特异性为96%～100%；假设亚临床酮病患病率范围为10%～30%，相应的阳性预测值≥76%，阴性预测值＞ 98%[21]。

Roos等同样使用PLS法建立了基于MIR的牛奶中Ac和BHBA的预测模型，并评估其用于检测亚临床酮病的准确性。该研究使用分段流动分析法对1 080份牛奶样的Ac和BHBA浓度进行测定，作为参照数据，傅立叶变模红外光谱（FTIR）预测结果与Ac和BHBA参照数据之间的相关系数分别为0.72与0.64，在验证集中的标准误差（SE）分别为0.184和0.064mmol/L；假设Ac与BHBA的阈值分别为0.15和0.10mmol/L，检测到Ac或BHBA高值的灵敏度为69%～70%，特异性为95%，假阳性为25%～27%，假阴性为6%～7%，该作者认为MIR预测的Ac和BHBA对于筛选亚临床酮病的奶牛以及用于评估亚临床酮病的畜群管理是有价值的[9]。Knegsel等使用Roos等建立的上述预测模型，用于评估奶牛是否患高酮血症，并将该方法与乳脂肪与蛋白质比率进行比较，其中奶牛患高酮血症定义为血浆BHBA浓度≥1200μmol/L，结果预测Ac和BHBA与乳脂肪蛋白比（66%）相比，前者检测高酮血症的敏感性更高（80%）[22]。

Drift等通过研究认为，单一使用MIR预测牛奶Ac或BHBA浓度作为牛奶高酮血症筛选指标精确度有限，其重新构建了具有随机群体效应的多变量逻辑回归模型，使用胎次、季节、脂肪与蛋白质比率以及MIR预测牛奶Ac和BHBA作为预测变量，该诊断模型在测试日检测高酮血症的最佳截止值（定义为灵敏度和特异性的最大总和）下，具有82.4%的灵敏度和83.8%的特异性，但其认为所提出的模型不适用于个体检测，而适用于群体监测[23]。随后Drift等也利用Roos等建立的模型预测了1 565头奶牛的牛奶Ac和BHBA浓度，并使用动物模型对二者进行了遗传参数评估，结果对应的遗传力估计值分别为0.16和0.10，该研究为减少奶牛泌乳早期高酮血症的育种提供了借鉴[24]。

Koeck等使用MilkoScan FT+（Foss, Hillerød, Denmark）自带的BHBA预测模型，对加拿大荷斯坦牛初乳期BHBA进行了预测，并使用单变量动物模型对其进行了遗传分析，使用双变量动物模型对其与脂肪蛋白比、体况评分、临床酮病和移位皱胃的遗传相关性进行了分析，结果发现在泌乳不同阶段，牛奶BHBA遗传力估计值为0.14～0.29，第一个测试日牛奶BHBA、脂肪蛋白比、身体状况评分与临床酮病的遗传相关分别为0.49、-0.35与0.48（均为中度遗传相关），而与皱胃移位的遗传相关性接近于零（0.07）[25]。随后Koeck等又定义了不同的BHBA，并研究不同BHBA与酮病的表型和遗传相关，定义的BHBA有：牛奶第一个测试日BHBA（5-40 DIM, BHBAFirst）、最大牛奶BHBA（5-100 DIM, BHBAMax）、标准偏差牛奶BHBA（5-100 DIM, BHBASD），三者的遗传力分别为0.13、0.12与0.02，酮病和牛奶BHBA性状之间的表型相关性低（0.14～0.19），但遗传相关较高，分别为0.70、0.64和0.82[26]。

Vosman等使用Drift等建立的酮病预测模型，对来自125万头奶牛的250万个MIR数据进行酮病预测，并用多性状公畜模型估算酮病遗传参数，结果发现，第一、二、三胎次的酮病遗传力分别为0.16、0.13与0.18，所有胎次酮病遗传力为0.24，并且第一和第二胎、第三胎次酮病之间的遗传相关分别为0.81与0.58，第二和第三胎次酮病之间的遗传相关为0.74[14]。

Grelet等从卢森堡、法国和德国的商业和实验农场收集牛奶样品，通过流动注射分析测定Ac（548个样品）与BHBA（558个样品）浓度，使用PLS法基于MIR分别建立了预测模型，结果Ac与BHBA预测模型的外部验证决定系数（Validation coefficient of determination, R2V）与SE分别为0.67与0.196mmol/L、0.63与0.083mmol/L[10]。

Belay等使用牛奶MIR建立了预测血液BHBA浓度的预测模型，使用血糖仪Optium Xido （Abbott, Winey, UK）测量了波兰牛的826个血液BHBA浓度，使用PLS法建立血液BHBA（对数转换）预测模型的R2V与SE分别为0.43与0.2397mmol/L，作者认为其不足以确定奶牛个体血液BHBA浓度的准确值；又使用其建立的模型对158 028个数据进行血液BHBA浓度预测，比较了间接预测（IP，只使用预测的BHBA）与直接预测（DP，将MIR降低为5或10个得分）对育种值评估的影响，结果使用单变量方差结构（即IP）比多变量协方差结构（即DP）结果更好[27]。同年，Belay等又采用其建立的预测模型对挪威奶牛的血液BHBA浓度进行了预测，并进行遗传参数估计，再结合临床酮病与牛奶生产性状（产奶量、乳脂率、乳蛋白率与乳糖率）进行遗传相关分析，结果哺乳期不同阶段预测血液BHBA浓度的遗传力估计值范围为0.250～0.365，临床酮病遗传力估计值为0.078；在第一个测试日预测的血液BHBA与临床酮病遗传相关性为0.469、与牛奶生产性状为中度遗传相关（产奶量为0.277、乳蛋白率为-0.367、乳脂率为0.033）[28]。

Chandler等分别采集658头和468头奶牛的血样与牛奶样品（泌乳天数在5～20d之间），检测了血样的BHBA浓度与牛奶的MIR数据，使用线性回归算法基于MIR建立了血样BHBA的预测模型，预测模型的R2与SE分别为0.43与0.2397mmol/L；再以血液BHBA浓度≥1.2mmol/L为阈值，鉴定出高酮血症患牛，使用仪器（Foss Analytical，Hillerød，Denmark）检测得到牛奶BHBA和Ac的浓度，结果多元线性回归模型与逻辑回归模型判别高酮血病准确率分别为81.3%～97.8%与82.6%～97.3%[1]。

2 MIR预测奶牛能量状态的研究

Mcparland等建立了基于MIR的荷斯坦牛能量状态预测模型，使用PLS法对268头牛（418个哺乳期）的数据进行分析，预测模型在数据的不同独立子集上进行外部验证，结果预测直接能量平衡与有效能量摄入量模型的R2与SE分别为0.75与0.95MJ/d、0.87与0.98MJ/d，该方法可能是预测大规模个体母牛能量状态的可行方法[17]。随后其又使用该方法对荷斯坦牛能量状态建立了预测模型，考虑了饲养管理（两种TMR日粮与放牧）、地区（英国和爱尔兰）与奶牛品种（荷斯坦与弗里斯牛），并加入了产奶量作为自变量，结果预测的直接能量平衡、体能量含量和能量摄入的准确度（即多次测定系数的平方根）分别为0.47～0.69、0.51～0.56和0.76～0.80，进一步证明了此方法的可行性[18]。

Mcparland等进一步建立了基于MIR的泌乳奶牛能量摄入预测模型，共收集378头放牧牛1 535个能量摄入数据，使用PLS将牛奶MIR光谱数据与能量摄入相关联，预测模型的R2为0.68，但当将产奶量作为预测变量包含在内时，可提高预测模型准确性（R2=0.70）[29]。

Mcparland等又估计了基于MIR预测能量摄入（energy intake ，EI）和EB的遗传参数，首先其根据1 270个测试日记录的实际采食量和能量数据，使用PLS法建立了适合试验牛群的EB和EI预测模型，结果其交叉验证准确度分别为0.75与0.73；对94 653个MIR数据进行EI与EB预测，再使用动物模型评估各性状的方差组分，计算对应遗传力与遗传相关，结果预测EI与EB的遗传力分别为0.20与0.10，而实际测量性状（使用1270个数据）的遗传力估计值分别为0.35与0.16；测量和预测EI之间的遗传相关性为0.84，测量和预测EB之间的遗传相关性为0.54，表明基于MIR预测EI或EB的选择将改善奶牛真实的EI或EB[16]。

Grelet等为研究奶牛泌乳早期的负能量平衡状态，从卢森堡、法国和德国的商业和实验农场收集牛奶样品，通过流动注射分析测定柠檬酸盐（506个样品），使用基于MIR的PLS法建立了预测模型，其模型的R2与SE分别为0.86与0.76mmol/L[10]。

Müllera等建立了基于MIR的奶牛EB预测模型，以自动称重槽计算对65头德国荷斯坦牛的EB进行了计算，使用线性回归模型以牛奶MIR、牛奶成分以及奶牛胎次和泌乳阶段信息相结合建立预测模型，结果在前4个泌乳周中，多胎母牛与初产母牛的EB预测模型交叉验证决定系数（Cross-calidation coefficient of determination, R2CV）分别为0.55与0.83，在第5～10个泌乳周中，多胎母牛与初产母牛EB预测模型的R2分别为0.57与0.71；同时采集了585个血样样本（来自相同的65头牛），进行血清BHBA浓度检测，使用相同线性回归模型建立了血清BHBA浓度预测模型，其R2为0.42；当以血液BHBA大于1 200μmol/L为阈值时，判别EB模型的灵敏度为44%～75%，特异性为93%～97%[2]。

表1 应用MIR预测奶牛疾病文献的研究总结

Mineur等尝试直接使用MIR判别奶牛是否患有跛足疾病，使用偏最小二乘判别分析（Partial least square discriminate analysis, PLS-DA）对9 811条数据进行了预测模型的建立，其中对MIR数据进行了两种预处理（一阶导数+标准化正态变换，二阶导数+标准化正态变换），并根据奶牛品种、胎次、跛足的严重程度划分为不同的子集进行了模型建立，结果不同预处理模型灵敏度不同，不同子集下得到的结果差异也较大，灵敏度为25%～85%，特异性为58%～92%。作者认为应进一步增加其他信息来提高模型的准确性[3]。

Luke等开发了基于MIR预测奶牛瘤胃pH值的预测模型，共收集了144个奶牛瘤胃pH值测量值，pH指标包括平均pH、pH低于6的时间和挤奶之间pH曲线下的面积、采集牛奶样品时的pH，使用PLS法建立预测瘤胃模型的R2在0.22～0.59之间；当奶牛亚急性瘤胃酸中毒（SARA）定义为瘤胃pH值小于6且超过180min时，使用PLS-DA建立判别奶牛SARA模型的敏感性为81%，特异性为72%[30]。

Koster等使用随机森林算法，并基于牛奶代谢物和酶、牛奶的免疫γ球蛋白部分上的聚糖、牛奶MIR来描述泌乳早期奶牛的代谢不平衡状态，其中牛奶代谢物和酶包括牛奶葡萄糖、葡萄糖-6-磷酸、BHBA、乳酸脱氢酶、N-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶、异柠檬酸、免疫球蛋白聚糖（19个峰）与牛奶MIR（1 060个波点降维为15个主要成分），结合使用或不使用其他奶牛信息（泌乳天数、胎次、产奶量）用于建立预测模型，结果使用牛奶代谢物和酶以及奶牛泌乳天数或MIR建立的预测模型最好，预测平衡的准确性为80%，不平衡的准确性为88%）[4]。

Luke等也同样研究了奶牛代谢不平衡预测模型的建立，其是通过血液BHBA、脂肪酸、尿素、Ca、Mg、白蛋白和球蛋白浓度来将奶牛分类，首先以PLS法建立了基于MIR的上述指标预测模型，结果血液BHBA、脂肪酸和尿素预测模型的 R2分别为0.48、0.61和0.90，但Ca、Mg、白蛋白和球蛋白浓度的预测效果很差（0.06≤R2≤0.17），使用PLS-DA法基于预测指标建立的判别代谢不平衡预测模型，灵敏度为25%～100%，特异性为6%～99%[30]。

4 小结

从上述研究中，可以看出MIR具有预测奶牛健康状况的潜力，并且结合奶牛其他信息（如产奶量）能提高预测模型的准确性，现在研究人员普遍认为此方法可以判别奶牛群体的健康状况，但对于个体水平的准确性有待提高。

随着我国牛遗传育种的发展，对获得大量、有效的奶牛疾病性状数据以进一步完善我国牛遗传评估体系的预望日益迫切。本综述介绍的基于MIR预测法提供了一个很好的途径，但上述研究均是基于国外牛群建立的模型，我国需要建立基于我国牛群的预测模型，以利于我国牛遗传育种的进一步发展。