食管鳞状细胞癌中环状RNA的生物学功能与调控机制研究

胡增涛，王微娜，孙东升，关沧海，姜兴明

管癌的发病率位居所有恶性肿瘤第八位，高发地区包括亚洲中部、伊朗与中国北部，按照组织学类型可分为鳞状细胞癌和腺癌[1-2]。食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)占我国食管癌的95%以上，位居癌症相关死亡原因第四位[3-4]。ESCC的高病死率主要是由于疾病早期诊断率低及确诊时约50%患者已发生肿瘤转移[5-6]。临床数据表明，ESCC晚期患者5年生存率低于20%，故早期诊断及治疗能显著改善ESCC患者预后，且术后10年生存率可达95%[7-11]。因此，寻找可行的早期筛查指标对于ESCC的诊治极为重要。有研究发现，相比于正常食管组织，ESCC中环状RNA(circular RNA, circRNA)存在显著性差异表达，参与调控ESCC的发生、发展，并且circRNA还与ESCC放疗敏感度及预后密切相关[12-17]。本文就ESCC中circRNA的生物学功能与调控机制进行阐述，为疾病的诊断与治疗提供新的思路。

1 circRNA概述

在20世纪70年代，Sanger等[18]通过电子显微镜发现类病毒是具有共价闭合环状结构与高热稳定性的单链RNA分子，亦是研究人员首次发现circRNA。最初研究人员认为circRNA仅在少数细胞中以低水平表达，但随着RNA测序与生物信息学技术的快速发展，科学家发现circRNA因其结构特性不受RNA外切酶作用，能够在哺乳动物细胞中稳定、保守地表达，具有细胞表型特异性及组织和发育阶段特异性[19-20]。此外，circRNA参与调控包括肿瘤在内的多种疾病的发生、发展，其主要生物学功能是充当微小RNA(miRNA)海绵、调节亲本基因转录及作为调控性蛋白质与编码性蛋白质相互作用的衔接子[21-23]。

2 ESCC中促癌功能circRNA

2.1CDR1反义RNA(CDR1 antisense RNA, ciRS)-7 Sang等[24]应用实时定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)对86例ESCC标本与正常标本进行检测，发现ESCC中ciRS-7呈异常高表达，并且表达水平与病理分级和临床分期密切相关，同时集落形成实验、划痕实验及Transwell实验均显示ciRS-7过表达能够促进ESCC细胞增殖、侵袭及迁移，与孟令娇等[25]研究结果一致。此外，Sang等[24]荧光素酶实验结果表明，ciRS-7与miR-876-5p、miR-876-5p及MAGE-A家族基因之间均存在结合位点，且外源性上调miR-876-5p表达能够抑制肿瘤细胞增殖、降低侵袭迁移能力、下调MAGE-A家族基因的表达，而ciRS-7过表达则能逆转上述抑制作用，同时MAGE-A家族基因表达上调能够促进ESCC细胞增殖与迁移；动物实验结果显示，ciRS-7过表达能够促进肿瘤生长并逆转miR-876-5p对ESCC恶性进展的抑制作用；免疫组织化学染色结果显示，miR-876-5p过表达组MAGE-A蛋白与增殖标志物的表达降低，而这种负向调控作用又受ciRS-7的抑制。

Li等[26]研究发现ciRS-7在ESCC组织中过表达，并且其表达水平可作为预后独立影响因素。有文献报道，ciRS-7能够内源性海绵吸附miR-7，而miR-7与HOXB13的3'-UTR中的互补序列相结合以下调其表达水平[27-28]，且过表达miR-7能够抑制肿瘤细胞增殖、侵袭与迁移，诱导HOXB13表达水平显著下调，同时miR-7的抑制作用均能通过重新引入ciRS-7来逆转。有研究表明，NF-κB信号通路的激活参与多种肿瘤的发生、发展，并且与HOXB13促进前列腺癌细胞转移及肺癌中ciRS-7促癌作用的发挥密切相关，同时过表达的HOXB13能够促进ESCC中p65磷酸化[29-30]。上述研究说明ciRS-7的上调能够消除miR-7对其下游靶基因HOXB13的抑制作用，诱导p65磷酸化，从而促进ESCC的恶性生物学行为。此外，有研究发现ciRS-7能够通过miR-7/KLF4分子轴上调磷酸化IKK-α的表达，进而推动ESCC的恶性进展[31]。

2.2环状RNA蛋白激酶C(circular RNA protein kinase C iota, circ-PRKCI) circ-PRKCI在ESCC中过表达，并且外源性上调circ-PRKCI表达能够促进肿瘤细胞的增殖与迁移[32]。核质分离实验结果表明circ-PRKCI主要位于胞质，提示circ-PRKCI可能参与介导转录后修饰；生物信息学预测结果显示，circ-PRKCI能够与miR-3680-3p结合，且miR-3680-3p在同一个位点与AKT丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT serine/threonine kinase 3, AKT3)存在合作关系；进一步研究发现ESCC中miR-3680-3p表达水平下降，AKT3表达水平上调，同时circ-PRKCI能够逆转miR-3680-3p mimics对ESCC细胞增殖、迁移及AKT3表达的抑制作用[32]。此外，Xia等[33]研究表明circ-PRKCI在ESCC中呈过表达(相比对照组平均上调8.75倍)，并且表达水平与肿瘤分化及TNM分期密切相关；CCK-8测定、集落形成实验与Transwell实验结果显示，降低circ-PRKCI表达能够显著抑制ECA-109与TE-13肿瘤细胞的增殖与侵袭迁移能力，且利用siRNA转染ECA-109与TE-13肿瘤细胞后能够下调Cyclin D的表达并诱导细胞周期停滞于G2期。

2.3circRNA_100876 Cao等[34]发现circRNA_100876在ESCC中的表达水平明显高于相邻正常组织，并且与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及血管侵袭密切相关；动物体内成瘤实验结果证实siRNA转染组小鼠肿瘤体积明显小于对照组；细胞实验结果显示，外源性敲除circRNA_100876能够在体外抑制ESCC细胞的增殖、侵袭及迁移，下调上皮间充质转化相关蛋白与转录因子的表达，诱导细胞周期停滞于G2/M期并促进其凋亡。

2.4其他circRNA Rong等[35]应用qRT-PCR对ESCC患者和健康者的血浆及ESCC患者肿瘤组织进行检测，发现环状RNA MAGUK支架蛋白1(circular RNA discs large MAGUK scaffold protein 1, circ-DLG1)表达水平显著上调，并且与TNM分期密切相关；CCK-8测定与集落形成实验结果表明，利用siRNA转染circ-DLG1高表达的K180和T10细胞能够有效抑制ESCC细胞增殖。Wang等[36]通过对ESCC患者及正常受试者血浆进行微阵列分析，发现环状RNA四肽重复结构域17(circular RNA tetratricopeptide repeat domain 17, circ-TTC17)的差异表达最为显著，同时ESCC中circ-TTC17呈过表达，并且其表达水平与TNM分期及淋巴结转移密切相关；细胞实验结果显示，外源性下调circ-TTC17的表达水平能够抑制肿瘤的增殖与迁移。Song等[37]研究发现hsa_circ_0000337在ESCC中的表达水平显著上调；动物实验结果表明外源性敲除hsa_circ_0000337能够抑制肿瘤细胞增殖与侵袭，促进肿瘤细胞凋亡；荧光素酶实验结果显示，hsa_circ_0000337与miR-670-5p存在结合位点。上述研究表明circRNA在ESCC中的下游靶基因与功能蛋白尚未明确，并且具体作用机制有待深入研究。

3 ESCC中抑癌功能circRNA

3.1环状RNA E3泛素蛋白连接酶(circular RNA itchy E3 ubiquitin protein ligase, circ-ITCH) 有研究发现，与相邻正常组织比较，circ-ITCH在ESCC中表达水平显著下调；皮下成瘤实验、CCK-8测定与集落形成实验结果表明，过表达circ-ITCH能够在体内与体外显著抑制肿瘤细胞的增殖；流式细胞术检测结果显示，circ-ITCH表达水平上调能够诱导ESCC细胞周期停滞于G1期；对circ-ITCH作用机制进行研究，发现其通过充当“分子海绵”与相应miRNA结合，进而上调下游基因E3泛素蛋白连接酶(itchy E3 ubiquitin protein ligase, ITCH)的表达，而ITCH的过表达能够促进蓬乱蛋白2的泛素化与降解、抑制T淋巴细胞特异转录因子的转录活性并下调肿瘤细胞中c-Myc与β-catenin的表达[38]。上述研究表明circ-ITCH通过调控Wnt/β-catenin信号传导途径在ESCC中发挥抗肿瘤作用。

3.2circ0043898 Wang等[39]应用转录组测序技术与qRT-PCR对ESCC标本织进行检测，发现差异表达的circRNA主要参与肿瘤蛋白多糖的合成及Rap1与mTOR信号通路，其中circ0043898在肿瘤组织中的表达水平较为稳定且明显低于正常组织；动物实验结果证实，circ0043898过表达组肿瘤的体积更小、重量更轻；MTS测定与集落形成实验结果显示，应用circ0043898过表达载体转染Kyse-520与ECA-109细胞后能够显著抑制其增殖能力；Transwell实验结果表明，外源性上调circ0043898表达能抑制肿瘤细胞侵袭与迁移，并且Kyse-520与ECA-109细胞凋亡百分比分别增加2倍和4倍，同时使细胞周期停滞于G1期。

3.3环状RNA SMAD家族成员7(circular RNA SMAD family member 7, circ-SMAD7) Zhang等[40]通过对ESCC患者及健康对照组血浆进行微阵列分析与qRT-PCR检测，证实circ-SMAD7在ESCC中表达水平显著下调，并且与TNM分期及淋巴结转移呈负相关，同时ESCC肿瘤细胞系TE10和KYSE30的circ-SMAD7表达水平最低；集落形成实验结果显示，外源性下调E10和KYSE30细胞中circ-SMAD7的表达能够促进肿瘤细胞增殖，而E10和KYSE30细胞内转染circ-SMAD7过表达载体则能够抑制肿瘤生长；伤口愈合测定实验结果表明，circ-SMAD7表达受抑制的ESCC细胞相较于健康对照组可表现出更高的迁移率，而circ-SMAD7过表达则能够抑制ESCC细胞迁移。

4 展望

从错误剪接的副产物到具有重要生物学功能的RNA分子，circRNA的功能随着研究的深入不断地被发掘。作为稳定、保守的非编码RNA，circRNA可作为肿瘤诊断标志物、治疗靶点及预后评估指标。目前我国ESCC发病率仍位于世界前列，ESCC中circRNA的研究对于临床诊治及预后评价具有重要意义。此外，circRNA在ESCC中的作用机制尚未阐明，其生物学功能的研究仍主要围绕于“分子海绵”机制，相信随着相关机制的进一步发现与阐明，circRNA有望作为新型生物学标志物在ESCC的筛查、诊断与治疗中获得更为广泛的应用。