免疫球蛋白基因重排在滤泡性淋巴瘤中的应用

2020-02-27 14:38张科平林丹义徐方平朱小兰骆新兰
临床与实验病理学杂志 2020年4期
关键词:重排滤泡淋巴瘤

许 洁,崔 倩,张科平,陈 洁,林丹义,徐方平,朱小兰,骆新兰

滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma, FL)起源于滤泡生发中心B细胞一类非霍奇金淋巴瘤,由于其症状不明显,就诊时,多数已为Ⅱ~Ⅲ期,因此早期诊断十分重要[1]。FL与淋巴滤泡反应性增生的鉴别诊断,绝大多数病例依据组织学特征并结合临床表现便可以做出明确诊断,也有不少疑难病例借助免疫组化、分子遗传等技术进行鉴别和确诊,基因重排分析确定B细胞增生的克隆性,有助于解决这一问题[2]。本文应用PCR-GeneScan法检测39例FL免疫球蛋白重链/轻链(IgH/L)基因重排,统计分析克隆性IgH/L基因重排与肿瘤分级的关系,探讨其对于滤泡性淋巴瘤早期诊断的作用。

1 材料与方法

1.1 标本收集2016年9月~2019年2月广东省人民医院病理科诊断的39例FL石蜡标本,均为手术标本,平均年龄(54.64±17.47)岁,根据WHO(2008)淋巴造血系统肿瘤分级标准[3],其中15例为FL1,7例为FL2,17例为FL3(11例为FL3A,6例为FL3B)。

1.2 主要仪器与试剂基因重排检测试剂盒(IgH3+IgK,PCR毛细管电泳法,CL220001),基因重排检测试剂盒(HE,PCR毛细管电泳法,CL220004),基因重排检测试剂盒(IgL,PCR毛细管电泳法,CL220006)由上海源奇生物公司提供,引物序列均来源于BIOMEN-2的研究成果[4];QIAamp石蜡标本DNA提取试剂盒(56404)购于德国Qiagen公司;去离子甲酰胺HIDI(ABI公司);分子内标GS500Liz(ABI公司);POP7胶(ABI公司);基因扩增PCR仪(美国ABI Veriti);基因测序仪(美国ABI3500DX);Nanodrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司)。

1.3 基因组DNA提取切取10 μm厚组织4片,切片贴于干净的玻片上。二甲苯脱蜡至水后,按照HE染色片所选取的肿瘤区域小心用无菌刀片将肿瘤组织刮入1.5 mL的EP管中。应用QIAamp石蜡组织DNA抽提试剂盒提取DNA。DNA利用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测其浓度及吸光度(A)值,经0.8%琼脂糖电泳判定其质量。

1.4 PCR+基因扫描法(1)PCR反应体系采用基因重排检测试剂盒(上海源奇生物公司)包括:模板DNA至少100 ng;PCR预混反应液包括IgH管A、B、C,IgK管A、B,IgL,对照基因管(引物序列参照BIOMED-2研究结果[4]);Ampli Taq Gold DNA聚合酶。各反应体系配制:PCR反应液16 μL+ Ampli Taq Gold DNA聚合酶1 μL+DNA(包括待检样本,相应的阳性对照、空白对照)3 μL。反应条件:95 ℃ 7 min,95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 90 s,合计40个循环,72 ℃ 10 min,4 ℃保存。(2)基因扫描试剂配制:PCR扩增产物1 μL+LIZ500 0.5 μL+HIDI 10 μL,变性条件:95 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min,将上述变性产物在基因测序仪上进行毛细管电泳。(3)结果判读:对照基因管若在100、200、300、395 bp收集到ROX荧光信号,表示DNA的质量符合实验要求,相应的阳性对照在有效的范围内收集到不连续的荧光信号,而空白对照未收集除引物峰以外的荧光信号,如实验满足以上有效条件,在有效范围内的1个或2个强阳性条带的样本提示基因重排为阳性,反之为阴性。

1.5 统计学分析所有数据应用SPSS 17.0软件进行统计学分析,采用χ2检验和Spearman等级相关检验。

2 结果

39例FL中有29例(29/39,74.36%)IgH/L基因重排阳性,其中,FL1基因重排的检出比例为8/15,FL2重排的检出比例为5/7,FL3重排的检出比例为16/17,仅1例FL3B未检出克隆性重排。Spearman等级相关检验和χ2检验结果显示,IgH/L基因重排在FL3中的检测率高于FL1、FL2,其检出率与FL的分级呈显著正相关(rp=0.376,P<0.001),FL1、FL2和FL3中表达差异有显著性(P=0.004),FL3A(11/11)与FL3B(5/6)检出率差异无统计学意义(P=0.209);15例IgH基因重排阳性(15/39,38.46%),联合IgK,检出率提升至74.36%(29/39),差异有统计学意义(P=0.003)。

3 讨论

FL是最常见的惰性淋巴瘤,根据WHO(2008)淋巴造血系统肿瘤分级标准,FL可分为3级,其中FL1和FL2属于低级别淋巴瘤,FL3属于高级别淋巴瘤,FL3可进一步分为3A和3B[3]。FL3尤其是FL3B常伴弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma)区域[5]。非霍奇金淋巴瘤是一种原发于淋巴结及其他淋巴组织的恶性肿瘤,克隆性重排是克隆性增生和谱系来源的标志,已被公认为淋巴瘤诊断、鉴别诊断和治疗后监测的重要指标[6];本组39例FL中,29例(29/39,74.36%)IgH/L基因重排阳性,检出率与国内报道相近[7-9],其中FL1基因重排的检出比例为8/15,FL2重排的检出比例为5/7,而FL3重排的检出比例为16/17,仅1例FL3B未检出克隆性重排,FL1、FL2和FL3中克隆性重排的检出率差异有统计学意义(P<0.05),FL3A与FL3B检出率差异无统计学意义(P>0.05);本实验结果显示,IgH/L基因重排在FL3中的检测率高于FL1、FL2,其检出比例与FL的分级呈正相关。80%~90%的FL中发现t(14;15)(q32;q21)染色体易位,其在FL形成和形成早期是一个关键性的分子改变,在FL1~2级中约占85%,而FL3级尤其是FL3B级中t(14;15)易位少见,仅占15%~30%,形成这种差异可能与FL3B级中无残留的滤泡中心细胞有关[10]。本组实验结果显示,PCR-GeneScan检测IgH/L基因重排在FL3的检出率高,有效地弥补了单纯FISH法检测t(14;15)(q32;q21)染色体易位的缺陷。对于FL,由于发生体细胞超突变,导致VH基因片段的缺失,使IgH基因扩增出现假阴性而检出率降低,IgK重排很少受体细胞超突变的影响,因此联合IgK重排的检测可大大提高诊断的检出率[11-12],本组39例FL中,15例(15/39,38.46%)IgH基因重排阳性,联合IgK检出率提升至74.36%(29/39),差异有统计学意义(P<0.05)。IgH、IgL基因重排被认为可作为B细胞非霍奇金淋巴瘤的辅助诊断方法,近年开展的PCR法基因重排检测技术,克服了传统技术存在操作繁杂、耗时长等缺点,广泛被应用;分析技术目前临床上主要为凝胶电泳异源双链分析和基因扫描分析。基因扫描可以产生清晰的峰图,可以探测到0.5%~1.0%的克隆性淋巴细胞,即使有一个碱基的差别,基因扫描后通过图像峰的位置、高度、大小展示,是一种十分灵敏和精确的检验手段,有着广泛的应用空间[13]。本实验使用PCR-GeneScan检测IgH/L基因重排,利用Ig基因重排检测对滤泡性淋巴瘤的诊断有辅助性作用,并且利用PCR-GeneScan法可提高重排检测的敏感性和特异性,对于滤泡性淋巴瘤的早期诊断有一定的价值,值得推广。

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