TIG-Fc真核表达载体的构建及其对自然杀伤细胞功能的影响

李国华, 高锦伟, 周希胜, 王霞, 程伟华

1.陕西省延安市延安职业技术学院, 陕西 延安 716000;

2.陕西省延安市安塞区中医医院, 陕西 延安 717400;

3.陕西省宝鸡市凤翔县医院, 陕西 宝鸡 721400;

4.陕西省宝鸡市中心医院肝胆胰脾外科, 陕西 宝鸡 721000

T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制性基序结构域[ T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif (ITIM) domain，TIGIT ]是近年来新发现的一种跨膜蛋白，是CD28家族的成员之一，TIGIT的基因位于人类第16号染色体，编码由244个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜蛋白[1-2]。TIGIT的结构包括胞外段的IgV结构域、跨膜结构域和胞内段的ITIM结构域。TIGIT仅限于在淋巴细胞上表达，其中表达水平较高的为CD4+调节性T细胞、CD4+滤泡辅助性T细胞、CD8+效应T细胞和自然杀伤(natural killer，NK)细胞，而在静息和活化B细胞表面均未检测到TIGIT的表达[3-5]。

近年来，TIGIT作为一种新型的免疫抑制性受体，在机体的免疫调节网络中扮演着重要角色，其对免疫细胞功能的影响也开始被重视。Yu等[6]的研究表明TIGIT可以作为配体作用于树突状细胞(dendritic cell，DC)表面的脊髓灰质炎病毒受体(polivirus receptor，PVR/CD155)，并证明了TIGIT通过PVR通路可以诱导DC细胞提高IL-10的分泌水平从而抑制免疫反应。Joller等[7]构建了TIGIT基因敲除小鼠，在无抗原提呈细胞存在的培养体系中，利用具有功能活性的TIGIT单克隆抗体刺激T细胞，出现免疫应答下调的现象，表明TIGIT可以直接抑制T细胞的增殖。此外，有研究发现，TIGIT不但表达于T细胞表面，其在NK细胞表面也有高水平的表达，而且对NK细胞发挥直接抑制作用[8]。

为了进一步探究TIGIT对NK细胞的免疫负调节功能及机制，本研究利用分子生物学方法，将携带人TIGIT胞外段(即TIGIT第1～135位氨基酸，以保留功能结构域IgV区，此胞外段简称为TIG)与人免疫球蛋白G3(immunoglobulin G3，IgG3)Fc段的基因融合，然后插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中，以构建重组质粒pcDNA3.1(-)-TIG-Fc。免疫球蛋白IgG3中的Fc段作为重要的蛋白融合标签，不但可以延长小分子蛋白质在体内的代谢时间，还可以作为识别标签用于目的蛋白的纯化[9-11]。随后通过检测细胞增殖和IFN-γ的分泌水平来明确TIG-Fc融合蛋白对NK细胞功能的影响，以期为研究相关疾病的免疫机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人TIGIT全长基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；含有人IgG3 Fc段的质粒由本实验室保存；真核表达载体pcDNA3.1(-)购自美国Ambion公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；NK-92细胞购于美国ATCC公司；人胚肾细胞HEK-293T由本实验室保存；抗人TIGIT [藻红蛋白(P-phycoerythrin，PE)标记]抗体购自美国eBioscience公司。

胰酶、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)均购自美国HyClone公司；限制性内切酶(NheⅠ和NotⅠ)、T4 DNA连接酶、Taq酶和高保真DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000购自美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen公司)；DMEM高糖培养基培养基购自中科迈晨(北京)科技有限公司(Macgene公司)。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所；人IFN-γ ELISA检测试剂盒购于厦门慧嘉生物科技有限公司；引物合成及DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 pcDNA3.1(-)-TIG-Fc真核表达载体的构建

分别以TIGIT全长基因序列和含人IgG3 Fc段的质粒为模板，利用Primer 5.0软件，设计TIGIT胞外段引物TIG-F和TIG-R，从TIGIT全长基因中扩增TIGIT的胞外段(TIG)；设计Fc段引物Fc-F和Fc-R，从含人IgG3 Fc段的质粒中扩增Fc片段。PCR反应体系为：DNA模板1 μL，正、反向引物各0.5 μL，Taq酶 0.3 μL，dNTP 2 μL，10×buffer 2.5 μL，去离子水补至25 μL。反应程序为：95 ℃预变性10 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。引物Fc-F在合成过程中加入一段连接肽(linker)DNA序列，便于通过PCR搭桥方式和Fc基因融合，从而实现2个片段间的重叠延伸过程(引物及linker序列见表1)。然后分别将PCR产物中的人TIG和IgG3 Fc片段回收，以TIG-F和Fc-R为引物进行重叠PCR，扩增获得TIG-Fc融合基因。扩增体系为：模板各1 μL，10×buffer 2.5 μL，Taq酶 0.3 μL，dNTP 2 μL，引物TIG-F和Fc-R各0.5 μL，去离子水补至25 μL。扩增程序为：95 ℃预变性10 min；94 ℃ 45 s，64 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃延伸 10 min。

将上述PCR扩增获得的融合基因和载体pcDNA3.1(-)分别用限制性内切酶NheⅠ和NotⅠ双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳切胶回收酶切产物。将pcDNA3.1(-)载体与回收的DNA片段以3∶1的摩尔比，在T4连接酶作用下，于16 ℃连接过夜，以构建pcDNA3.1(-)-TIG-Fc重组质粒。随后，通过DH5α感受态转化，将其产物取100 μL均匀涂布于LB/Amp的平板中，37 ℃培养过夜，再挑取平板上生长的单克隆于37 ℃、250 r·min-1培养16～18 h，再通过PCR扩增进行鉴定。扩增体系为：菌液 2 μL，TaqPCR Master Mix 10 μL，引物TIG-F和Fc-R各0.5 μL，去离子水补至25 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。选择鉴定为阳性的菌液用质粒小提试剂盒提取重组质粒，进行双酶切验证后，交至生工生物工程(上海)股份有限公司测序鉴定。

表1 本研究所用引物序列

1.3 细胞培养和转染

将人293T细胞在37 ℃、5%CO2条件下培养于添加10% FBS的高糖DMEM培养基中；将NK-92细胞培养于含12.5%FBS、12.5%马血清和终浓度100 U·mL-1重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhIL-2)的α-MEM培养液中。在真核细胞转染的过程中，细胞培养至指数增长期，待其状态良好时进行实验，根据LipofectamineTM2000的试剂说明瞬时转染细胞，具体步骤如下：分别用约200 μL的无血清的DMEM高糖培养液稀释9 μL pcDNA3.1(-)-TIG-Fc(浓度为447 ng·μL-1)质粒和10 μL LipofectamineTM2000脂质体，充分混匀后室温静置5 min，然后将2管液体等量混合，轻轻混匀后静置15 min即为转染工作液。将细胞换至无血清培养液，将配置所得转染工作液轻轻缓慢加入细胞中，于37 ℃孵育4～6 h后更换成10% FBS培养液，培养48 h后收集细胞进行检测。

1.4 流式细胞仪检测

采用脂质体介导基因转染的方法，转染前1天，将处于对数生长期的细胞接种于6孔板内，于不含抗生素的培养基中培养，第2天进行细胞转染，细胞密度为80%左右，细胞分为空白组、阴性对照组(用LipofectamineTM2000转染空质粒)、转染组。转染完成后培养细胞48 h，用预冷PBS清洗细胞1次，然后每孔加入200 μL不含EDTA的胰酶消化液，放入孵箱内，观察细胞状态，镜下观察细胞变圆、细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀，以制备细胞悬液，2 000 r·min-1离心5 min，弃上清，用300 μL 4%多聚甲醛重悬，室温避光固定30 min后，PBS清洗3次；细胞膜打孔，加入200 μL 0.2% TritonX-100，室温静置20 min后再用PBS清洗2次，重悬细胞，每管加入PE标记的抗人TIGIT抗体5 μL，37 ℃避光孵育30 min，PBS清洗2次，弃上清，500 μL PBS重悬细胞，上机检测TIG-Fc融合蛋白在细胞内的表达水平。

1.5 Western blot法检测

将对数生长期的人293T细胞接种于6孔板中，细胞分为空白组、阴性对照组(用LipofectamineTM2000转染空质粒)和转染组，同样采用脂质体转染的方法，将质粒转染至293T细胞中，转染完成后培养细胞24 h。随后收集细胞总蛋白，采用BCA法测定蛋白质浓度，进行蛋白质电泳后，转移至硝酸纤维素膜上；用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗，稀释比例为1∶500，于4 ℃孵育过夜；TBST洗膜5次，每次5 min，洗涤后，加入二抗，稀释比例为1∶1000，于37 ℃孵育1 h；TBST洗膜5次，每次5 min，用化学发光法显色，以空白与阴性为对照，检测TIG-Fc融合蛋白表达情况。

1.6 细胞增殖实验

利用WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测转染的重组质粒pcDNA3.1(-)-TIG-Fc对NK-92细胞增殖能力的影响。取对数生长期的NK-92细胞，分别以6 000个/孔的细胞密度接种于96孔细胞培养板中，于37 ℃细胞培养箱中培养过夜。将细胞分为空白组、阴性对照组(用LipofectamineTM2000转染空质粒)、转染组，每组设6个复孔，每孔200 μL溶液，根据LipofectamineTM2000转染试剂说明瞬时转染细胞，待转染6 h后，换成含10%血清的完全培养基继续培养，48 h后更换为无血清培养基，之后每孔换为事先配好的WST-1溶液100 μL，在细胞培养箱内继续孵育1～2 h，随后，充分混匀待检测体系，利用酶标仪检测450 nm处吸光度，其吸光度(OD值)代表其增殖率[12]。

1.7 ELISA检测

将pcDNA3.1(-)-TIG-Fc表达质粒转染入培养于6孔板的NK-92细胞中，细胞分为空白组、阴性对照组(用LipofectamineTM2000转染空质粒)、转染组，培养48 h后，吸取细胞培养上清，1 000 r·min-1离心20 min，吸取上清检测即可。具体步骤如下：将预先纯化的IFN-γ抗体包被微孔板于室温平衡30 min，每孔加入100 μL待测样品，37 ℃温育2 h(每组样品做3个复孔)，弃液体，甩干，每孔加检测溶液A工作液100 μL，37 ℃温育1 h，PBS洗板5次，再每孔加检测溶液B工作液100 μL，37 ℃温育1 h，再用PBS洗板5次，加入底物显色液反应30 min显色，迅速终止反应，在酶标仪450 nm波长处测量各孔吸光度(OD值)，按照标准曲线并结合OD值计算各组浓度，结果以pg·mL-1表示。

1.8 数据统计分析

利用Excel软件进行统计学分析，每组实验至少重复3次，数据采用“均数±标准差”表示，采用单因素方差进行差异显著性分析，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 pcDNA3.1(-)-TIG-Fc表达载体的构建与鉴定

分别以TIGIT全长基因序列及含人IgG3 Fc段基因的质粒为模板，PCR扩增TIG和Fc的基因片段，产物长度分别为396 bp和744 bp(图1A)。通过重叠PCR将2个片段拼接为TIG-Fc，产物长度为1 114 bp，经琼脂糖凝胶电泳验证产物与理论基因片段长度一致(图1B)。对TIG-Fc融合基因片段和pcDNA3.1(-)表达载体进行双酶切，再经T4连接酶连接，获得重组表达质粒pcDNA3.1(-)-TIG-Fc，随机挑取7个单菌落进行菌液PCR验证，结果显示3～7号克隆的目的基因连接成功(图1C)，取3号单克隆测序分析，测序结果表明TIG-Fc基因序列正确，无插入或缺失突变。

2.2 TIG-Fc融合蛋白在293T细胞中的表达

将pcDNA3.1(-)-TIG-Fc质粒通过脂质体法转染至293T细胞中，利用流式细胞术检测其蛋白表达情况。由图2可知，在转染空载体的阴性对照组中TIG-Fc融合蛋白表达较低，转染组中TIG-Fc蛋白表达显著升高，阳性率达77.14%(标记TIGIT)，转染组与2个对照组之间的差异具有统计学意义(P<0.05)，说明融合质粒构建成功并在293T细胞中表达。

A：TIG和Fc的基因片段的电泳图 M—DNA Marker(Takara 3519Q)，1—IgG3 Fc段基因，2—TIGIT胞外段(TIG)基因；B：重叠PCR扩增产物的电泳图 M—DNA Marker(Takara 3582Q)，1—重叠PCR扩增产物；C：菌液PCR扩增产物的电泳图 M—DNA Marker(Takara 3582Q)，1～7—1～7号单克隆PCR扩增产物。

注：M1：阳性细胞；Al：即All，所有细胞；Marker：分类；% gated：门内细胞的百分比。

2.3 Western blot法鉴定转染细胞系中融合蛋白的表达

将构建成功的TIG-Fc重组质粒转染至293T细胞中，24 h后提取总蛋白，利用Western blot检测其蛋白表达情况。由图3可知，当用抗TIGIT抗体免疫印迹时，转染组出现目标条带，分子量约为40 kDa，与TIG-Fc大小基本一致；而2个对照组无表达。这说明重组质粒能够在293T细胞中正确表达TIG-Fc融合蛋白。

2.4 TIG-Fc对NK细胞增殖的影响

将pcDNA3.1(-)-TIG-Fc表达质粒转染至NK-92细胞系中，利用WST-1实验检测细胞的增殖情况。由图4可知，转染组的细胞增殖率(0.532±0.07)显著低于阴性对照组(0.953±0.04)(P<0.05)，而空白对照组与阴性对照组之间的差异不具有统计学意义(P>0.05)，表明过表达TIG-Fc能够显著抑制NK-92细胞的增殖，抑制率达50%左右。

注：A—空白对照组；B—阴性对照组；C—转染组

注：不同小写字母表示不同处理间的差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.5 TIG-Fc对NK-92细胞分泌IFN-γ水平的影响

由图5可知，pcDNA3.1(-)-TIG-Fc转染组的IFN-γ水平为(325.3±46.5)pg·mL-1，较空白对照组和阴性对照组显著降低(P<0.05)；而空白对照组和阴性对照组之间的差异不具有统计学意义(P>0.05)。由此推测，TIG-Fc可通过抑制NK-92细胞分泌IFN-γ，进而抑制NK细胞的增殖与活化。

注：不同小写字母表示不同处理间的差异具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

近年来，TIGIT作为一种新进的抑制性分子，其与免疫细胞间的相互作用逐渐受到重视。TIGIT是NK细胞和T细胞共有的抑制性受体，归类于CD28家族，与其配体PVR(CD155)、CD112结合后被激活，不仅可以抑制T细胞的功能，还能促进NK细胞的免疫抑制作用[13-15]。NK细胞是机体内一种重要的免疫细胞，在抗肿瘤、抗病毒和抗胞内寄生菌方面发挥着重要作用，NK细胞的活性是通过共刺激信号和共抑制信号之间的平衡来调控的，其参与抵抗肿瘤的第一道防线，NK细胞能够通过其表面的一系列抑制性受体、活化性受体和粘附受体，来区分识别应激转化后的被感染的细胞和健康的细胞[16]。有研究指出：对外周血NK细胞表面的TIGIT表达进行检测，结果发现系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)患者外周血NK细胞表面TIGIT的表达显著低于健康对照组，且其表达与疾病活动度、抗体产生及炎症程度相关，提示TIGIT可作为疾病活动度评价的指标[17]；PVR表达于肝细胞的表面，接受TIGIT配体的刺激，通过抑制NK细胞的功能，来减轻炎症，促进肝细胞的再生[18]；CD226和CD96作为新发现的NK细胞表面活化性受体，在机体抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用，但TIGIT与CD266和CD96同时活化时，TIGIT对NK细胞的抑制性作用占主导地位[8]。

为了进一步研究TIGIT蛋白对NK细胞增殖及分泌细胞因子功能的影响，本研究首先构建了pcDNA3.1(-)-TIG-Fc的真核表达载体。在前期设计引物时，在TIG与Fc 2个基因间插入了一段柔性链，此段柔性肽的分子极性小，且富含甘氨酸和丝氨酸，易于弯曲，具有一定的弹性，使融合蛋白的2个部分有较大的间隔，保持活性必需的空间构象，并且避免了融合蛋白的2个部分产生相互作用[19]。

在成功构建TIG-Fc融合基因的基础上，将其转染至NK-92细胞中，研究发现，与2个对照组相比，转染了pcDNA3.1(-)-TIG-Fc质粒的NK-92细胞的增殖能力显著降低(P<0.05)，并且细胞分泌IFN-γ的水平显著降低(P<0.05)，表明TIG-Fc融合蛋白的表达可以影响NK细胞的功能。γ干扰素(IFN-γ)是Ⅱ型干扰素，主要由活化的T细胞和NK细胞产生，能够激活NK细胞等，从而增强免疫应答能力，是机体发挥免疫功能、清除体内病原体不可缺少的成分，具有强大的免疫调节作用和抗病毒、抗肿瘤的作用[20]。TIG-Fc在NK-92细胞的过表达使细胞分泌IFN-γ 的水平降低，这也进一步表明TIG-Fc可以直接抑制NK细胞的活化。

综上所述，本研究初步阐述了TIGIT对NK-92细胞增殖功能及分泌细胞因子功能的影响，但是TIGIT是如何发挥功能的,以及其分子机制仍有待深入研究。除此之外，TIGIT蛋白可以抑制多种自身免疫性疾病的发生和发展，如迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity response，DTH)[6]、自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalo-myelitis，EAE)[7]、SLE[17]和小鼠的移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)[21]。这些都和TIGIT蛋白对T细胞和NK细胞的抑制功能有关。也有研究报道阻断TIGIT可重塑NK细胞的功能，从而抑制肿瘤生长[22]。总之，TIGIT作为新兴的抑制分子，其在免疫调节疾病中的作用越来越突显，也为后续研究疾病机制开阔了思路。