牛奶中氟喹诺酮类药物残留同步快速检测的酶联免疫吸附法研究

李燕君，谭梅，岳秀英，陆强，吴晓岚，吕晓华*

(1.四川大学华西公共卫生学院/四川大学华西第四医院，四川 成都 610041；2.四川省兽药监察所，四川 成都 610041)

氟喹诺酮类药物(fluoroquinolones，FQs)是目前广泛应用于畜牧业的第三代喹诺酮类药物，由于耐药性致病菌的产生、继发的不良反应及潜在致癌作用，FQs残留问题受到各国的高度关注[1-3]。本文探索一种快速同步检测牛奶中多种FQs残留的酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，为基层现场监测牛奶中FQs残留提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品 牛奶样品，购于超市。

1.2 主要仪器 Thermo Multiskan Go酶标仪(配备450 nm滤光片)(Thermo)，CPA225D电子天平(赛多利斯)，X-200漩涡混合仪(Labnet)，Eppendorf 5810R冷冻离心机(Eppendorf)，单道和多道微量移液器(Eppendorf)。

1.3 标准品和主要试剂 氟喹诺酮类药物残留酶联免疫检测试剂盒(北京勤邦生物技术有限公司)，试剂盒中提供0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg/L环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星药物系列标准溶液，试验用水符合GB/T 6682-2008规定。

1.4 方法

1.4.1 样品前处理 准确量取25 μL牛奶于2 mL离心管中，加入稀释后复溶工作液475 μL，混合，用涡旋仪涡动1 min，取50 μL用于分析。

1.4.2 检测方法 所有操作均在20℃～25℃下进行。

使用前将试剂盒置于室温(20 ℃～25 ℃)平衡30 min以上，注意每种液体试剂使用前摇匀，取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋，保存于2 ℃～8 ℃，将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两个平行实验；加入50 μL标准溶液或试样溶液到微孔底部，每孔再加入50 μL抗体工作液和酶标二抗浓缩液的混合液，轻轻振荡混匀，用盖板膜封板，25 ℃避光环境中反应30 min；倒出孔中液体，将酶标板倒置在吸水纸上拍打，去除孔中液体，每孔加250 μL洗涤液，10 s后倒出孔中液体，用吸水纸拍干，如此重复操作共洗板5次；加入50 μL底物溶液A和50 μL底物溶液B到微孔中，轻轻振荡混匀25℃环境避光显色15 min；加入50 μL终止液到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

1.4.3 50%抑制浓度 50%抑制浓度可评价检测方法的灵敏度[4]。分别测定10次标准曲线的50%抑制浓度。标准曲线中10次0浓度的标准液50%抑制处所对应的药物浓度值，即为50%抑制浓度。

1.4.5 加标回收试验 在牛奶样品加入FQs系列标准溶液，分别配制5.0、25.0和50.0μg/L 三个添加浓度，ELISA法测定样品中FQs含量。每批(日内)每一浓度重复测定5次，共做3个批次(日间)。计算各质量浓度的批内和批间变异系数(CV)。

2 结果与分析

2.1 ELISA法的50%抑制浓度和最低检测限 如表1所示，ELISA法的50%抑制浓度的范围在0.254～0.361μg/L。ELISA法的最低检测限为1.48μg/L。

表1 ELISA法的50%抑制浓度

2.2 ELISA法的加标回收率 如表2所示，在牛奶中添加5μg/L环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星药物时，回收率为87.20%～115.92%；添加25 μg/L 环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星药物时，回收率为84.58%～112.91%；添加50 μg/L环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星药物时，回收率为87.10%～113.28%。

2.3 ELISA法的加标试验的批内和批间变异系数 如表2所示，在环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星药物添加浓度为5、25、50 μg/L时，批内变异系数均小于15.0%，批间变异系数均小于16.0%。

表2 ELISA法的加标回收试验结果

续表

3 讨论与结论

FQs是一类重要的兽用抗菌药，对金黄色葡萄球菌等多种细菌有很强的抗菌活性，常被用作治疗奶牛乳房炎等疾病[4]。研究表明，FQs残留可通过食物链进入人体，对人体多系统造成损伤，并导致耐药性致病菌的产生[5]。FQs在禽畜体内具有良好的药代动力学特征，可穿过血乳屏障进入乳腺，在泌乳动物乳汁中呈聚集现象[6]。我国农业部虽已规定了牛/羊奶中恩诺沙星的最大残留限量(Maximum residue limits, MRLs)为100 μg/kg，达氟沙星的MRLs为30 μg/kg[7]，但由于奶牛泌乳期超量、盲目或不按休药期规定等滥用FQs，牛奶中FQs残留超标问题依旧严重。在基层工作中，经常面临现场对大量样品的检测，因此，探索FQs多残留的快速检测方法十分必要。

目前国内外常用的兽药残留检测技术有确证法和筛检法[8]。确证法主要包括高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法等，因其检测结果稳定、准确度高、重现性好，广泛应用于动物性食品的兽药残留分析中[9-13]。但确证法仪器昂贵，前处理复杂、检测时间长、操作繁琐，使得其无法满足大样本量的快速检测。筛选法中胶体金试纸条快速检测法虽检测时间短，但由于检测限高、灵敏度差、假阳(阴)性率偏高，难以保证结果的准确可靠性[13]；而ELISA法灵敏度高、特异性强、分析成本低、操作简便快捷，试剂盒检测时间仅约1.5 h，且样本仪器化程度低、前处理简单，尤其适合于现场大批量样品的快速检测，极易在基层推广[14]。目前已有用于猪肉、牛肉、鸡蛋、牛奶等中FQs残留检测的报道[15-18]，然而已有的ELISA法仅对某一种或一类FQs药物进行残留检测，且灵敏度、准确度有待提高，因此有必要进一步探索大批量快速检测牛奶中多种FQs残留的ELISA法。

本文建立了一种同时测定牛奶中环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星等六种FQs残留的ELISA法，试验结果表明，本文所建立的ELISA法的最低检测限为1.48 μg/L，50%抑制浓度的范围在0.254～0.361 μg/L，在环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星和洛美沙星药物添加浓度为5、25、50 μg/L时的回收率为84.58%～115.92%，批内变异系数均小于15.0%，批间变异系数均小于16.0%，该方法的精密度(变异系数)、回收率和最低检测限等均符合兽药残留试验技术规范的要求[19]，且回收率和最低检测限与高效液相色谱法[20]、高效液相色谱-串联质谱法[21]接近，优于现常用的高效液相色谱荧光检测法[22-23]，具有较高的灵敏度、准确度，极易在基层工作中推广普及，适合大批量样本的快速检测。

综上，氟喹诺酮类药物残留同步快速检测的酶联免疫吸附法符合兽药残留试验技术规范的要求，简便快捷，灵敏度、准确度和精密度高，适用于牛奶中FQs残留的快速检测。