苦参功劳颗粒中盐酸小檗碱含量测定研究

杨会鲜，姚路路，周冰，张聪，周德刚

(洛阳惠中兽药有限公司，洛阳 471000)

苦参功劳颗粒为国家三类新兽药，由十大功劳、苦参、木香组成,具有清热燥湿、止痢、行气健脾之功效，主治湿热泻痢，鸡大肠杆菌病。

十大功劳为本方的君药，属小檗科十大功劳植物。研究报道十大功劳叶含小檗碱、掌叶防己碱、药根碱、四氢药根碱和木兰碱等生物碱，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤以及杀虫之功效[1-5]。目前研究最多的是十大功劳的抗菌作用。Cernakova等[6]发现从十大功劳中分离得到的小檗碱对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等17种细菌也具有抑制作用。

盐酸小檗碱为十大功劳的特征性有效成分，十大功劳为本方的君药，故选择盐酸小檗碱作为本品质量控制的指标成分。本文对苦参功劳颗粒中盐酸小檗碱含量测定方法进行了研究，建立了苦参功劳颗粒中盐酸小檗碱含量的测定方法，用于苦参功劳颗粒质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器与试剂 Waters e2695高效液相色谱仪，配2489型紫外检测器，美国Waters公司；KQ-500超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司，AB135-S型电子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司；乙腈、甲醇、磷酸，HPLC级，磷酸二氢钾为分析纯；水为超纯水。

1.2 试药 盐酸小檗碱对照品(中国兽医药品监察所，批号：Z0221206，含量：94.5%)、苦参功劳颗粒(洛阳惠中兽药有限公司，批号：20140401，20140402，20140403，规格：每1 g相当于原生药3 g)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性 色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调pH值至3.0)(30∶70)；柱温：30 ℃；检测波长：265 nm；进样量：10 μL。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加乙腈-水(3∶7)制成每1 mL含0.02 mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液 取本品研细后的细粉约0.5 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加乙腈-水(3∶7)35 mL，超声处理(功率150 W，频率25 kHz)10分钟，放冷，加乙腈-水(3∶7)定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 按处方制备缺十大功劳的阴性对照样品，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验 分别取2.2项下对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图(图1)。从图中可见，供试品与对照品色谱中，盐酸小檗碱峰保留时间一致，阴性对照在盐酸小檗碱相应保留时间处无干扰峰，含量测定方法专属性良好。

1. 盐酸小檗碱对照品 2. 供试品 3. 阴性对照

2.4 线性试验 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加乙腈-水(3：7)制成196.6 μg·mL-1的对照品溶液，依次稀释成浓度为78.6、39.3、19.7、9.8、4.9 μg·mL-1的对照品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图峰面积，以峰面积Y为纵坐标，盐酸小檗碱浓度X为横坐标，绘制标准曲线。回归方程为：Y=41037X-1794.7(r=1)。表明盐酸小檗碱在4.9 μg·mL-1～78.6 μg·mL-1的范围内，峰面积与浓度线性关系良好。结果见表1和图2。

表1 线性关系试验结果

图2 盐酸小檗碱含量测定标准曲线

2.5 精密度试验 取专属性考察项下对照品溶液，按上述色谱条件精密吸取10 μL注入液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图峰面积，结果RSD=0.4%，表明仪器精密度良好。结果见表2。

表2 进样精密度试验结果

2.6 重复性试验 取苦参功劳颗粒(批号20140401)，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，分别制备6份，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，结果RSD为0.3%，表明本方法重复性良好。结果见表3。

表3 重复性试验结果

2.7 溶液稳定性试验 取苦参功劳颗粒(批号20140401)，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h测定峰面积，结果RSD为1.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定，见表4。

表4 稳定性试验结果

2.8 加样回收率试验 取已知含量的苦参功劳颗粒(批号 20140401)6份，每份约0.25 g，精密称定，置50 mL量瓶中，各精密加入0.1966 mg/mL的对照品溶液3 mL，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，按拟定的含量测定方法，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，测定样品含量并计算回收率，结果见表5，加样回收率在101.38%～103.74%之间，平均值为102.7%，RSD为0.8%，表明方法准确度良好。

表5 回收率试验结果

2.9 耐用性试验 取苦参功劳颗粒(批号：20140401)，按照“2.2.2”项制备供试品溶液，当柱温、流速发生微小变化以及使用不同型号的色谱柱，分别测定样品的峰面积，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表6。结果表明，当柱温、流速发生微小变化以及使用其他型号的色谱柱时，对含量测定结果基本无影响，表明方法耐用性良好。

表6 耐用性试验结果

2.10 三批样品含量测定 取苦参功劳颗粒样品(20140401，20140402，20140403)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算苦参功劳颗粒中盐酸小檗碱的含量，三批样品测定结果见表7。

表7 样品含量测定结果

3 讨论与结论

3.1 苦参功劳颗粒含量测定方法选择 《中国兽药典》2010年版二部十大功劳标准中未规定盐酸小檗碱含量测定，文献有不同产地十大功劳含量测定方法报道[7-9]，但并未有苦参功劳颗粒中十大功劳所含盐酸小檗碱含量测定方法。参考《中国兽药典》2010年版功劳木药材中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀含量测定方法，建立了苦参功劳颗粒中盐酸小檗碱含量测定。

3.2 色谱条件的考察 参照《中国兽药典》2010年版二部功劳木药材中盐酸小檗碱和盐酸巴马汀含量测定方法，确定流动相为乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液。通过不同流动相比例、柱温、流速、不同色谱柱及pH值的耐用性考察，从各因素保留时间和分离度可以看出，柱温、pH值对盐酸小檗碱的色谱行为影响较小，流动相比例、流速对盐酸小檗碱的保留时间影响较大，色谱柱型号变化对盐酸小檗碱的色谱行为影响较大，但分离度均符合要求，且对含量测定结果无显著影响，说明方法耐用性良好。

3.3 结论 通过专属性、线性、精密度、重复性、稳定性、加样回收率、耐用性的方法验证，结果表明苦参功劳颗粒中盐酸小檗碱含量测定以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调pH值至3.0)(30∶70)为流动相，检测波长为265 nm，流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)的色谱条件，专属性强、准确度高、耐用性好，操作简单，可用于苦参功劳颗粒中盐酸小檗碱的含量控制。