具有癌变潜能胃炎的炎性细胞表型特征及其差异表达基因富集通路分析

李一芷 燕丽容 袁 媛 徐 倩

中国医科大学附属第一医院肿瘤病因与筛查研究室(110001)

背景：胃癌，特别是肠型胃癌是由非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生-癌变的过程发展而来。目的：探讨易于癌变的胃炎(萎缩性胃炎)和不易于癌变的胃炎(非萎缩性胃炎)的炎性细胞表型特征及其差异表达基因富集的通路。方法：从GEO数据库中下载GSE2669、GSE83389、GSE106656和GSE27411数据集，采用R语言筛选差异表达基因，并采用GSE116312数据集进行验证。三个“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”数据集筛选出的差异表达基因与炎性细胞表型特征基因取交集，筛选出的差异表达基因行REACTOME和KEGG分析。结果：在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”的疾病动态链中，筛选出多种差异表达基因，以GSE116312数据验证后得到5个共同差异表达基因。3个数据集共筛选出85个炎性细胞表型特征基因，在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎”疾病链中中性粒细胞比例较高，在“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病链中为成纤维细胞和巨噬细胞。REACTOME和KEGG分析发现，“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病链中，差异表达基因富集于IL-10、IL-4和IL-13信号通路以及抗原处理与呈递信号通路。结论：具有癌变潜能胃炎的炎性细胞表型特征多为巨噬细胞、中性粒细胞和成纤维细胞，多富集于IL信号通路以及抗原处理与呈递信号通路。

胃癌是世界上发病率占第四位、致死率占第三位的恶性肿瘤[1-2]。按Lauren分型，将胃癌分为肠型和弥漫型[3]。 弥漫型胃癌的病因和机制至今未完全清楚[4]，而肠型胃癌是由“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生-癌变”的疾病链发展而来[5-6]。 从病理学角度来看，正常胃黏膜、非萎缩性胃炎、萎缩性胃炎均伴有不同程度的炎性细胞浸润。

一般而言，仅1%～3%的胃炎患者最终发展成为胃癌[7]。发展为胃癌的胃炎可能存在某些特定的特征。本研究通过应用生物信息学比较易于癌变的胃炎(萎缩性胃炎)与不易于癌变的胃炎(非萎缩性胃炎)之间的差异表达基因，并进一步分析这些差异表达基因中炎性细胞表型特征基因的分布情况，以及这些差异表达基因涉及的通路，旨在探索易于癌变胃炎的炎性特征及其可能涉及的通路，从而为阐明其涉及的富集通路提供一定的生物信息学依据。

资料与方法

一、研究设计

从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)中选取符合纳入标准的基因表达数据集，进行差异表达基因分析，并将明显差异表达基因在GSE116312数据集中进行验证；然后与炎性细胞表型特征基因取交集，筛选出的差异表达基因进一步行REACTOME和KEGG通路分析。

二、微阵列数据选取

微阵列数据来自于GEO数据库，检索关键词为“非萎缩性胃炎、“萎缩性胃炎”和“异型增生”。纳入的数据集需满足以下要求：①样本来源为人源样本；②样本分组需包含“非萎缩性胃炎”、“萎缩性胃炎”和“异型增生”中的两组；③每组样本例数大于3例。 经仔细筛选后，共纳入4个GEO数据集，分别为GSE2669、GSE83389、GSE106656和GSE27411。GSE2669数据集中，正常胃黏膜11例，非萎缩性胃炎26例，萎缩性胃炎22例；GSE83389数据集中，萎缩性胃炎62例，异型增生12例；GSE106656数据集中，非萎缩性胃炎14例，萎缩性胃炎7例；GSE27411数据集中，正常胃黏膜6例，非萎缩性胃炎6例，萎缩性胃炎6例。检索最新发表的数据集(检索时间截止至2020年9月30日)，将GSE116312数据集作为验证集。

三、炎性细胞表型特征基因分析

为评估“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病链中炎性细胞表型特征的动态变化，利用差异表达基因与炎性细胞表型特征基因取交集，评估疾病动态链中炎性细胞表型特征的改变。

四、REACTOME通路分析

利用炎性细胞表型特征差异表达基因，使用REACTOME通路数据库(https://reactome.org/PathwayBrowser/#/DTAB=MT&TOOL=AT)进行REACTOME通路富集分析，以P<0.05设定为纳入标准。

五、KEGG通路分析

对炎性细胞表型特征差异表达基因进行KEGG通路富集分析，使用R语言Cluster Profile 程序包中的enrichKEGG函数对差异基因进行富集分析，设定参数：pvalueCutoff=0.01，qvalueCutoff=0.05。

六、蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建

利用String数据库(https://string-db.org/)对GSE27411以及GSE106656数据集中炎性细胞表型特征差异基因进行PPI网络构建并可视化，以评估差异表达基因之间可能的相互作用关系。

七、数据处理

采用R软件(版本3.4.3)进行分析。为避免四组数据的本底差异，采用单独分析再整合的方法进行研究。当方差齐时，使用Student-t检验，否则使用Wilcoxon检验。利用Benjamini & Hochberg法校正P值。P<0.01判定为存在差异。

结 果

一、“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生”中差异表达基因

GSE2669数据集中，正常胃黏膜与非萎缩性胃炎之间有286个明显差异表达基因，萎缩性胃炎与非萎缩性胃炎之间有970个明显差异表达基因；GSE27411数据集中，正常胃黏膜与非萎缩性胃炎之间有744个明显差异表达基因，萎缩性胃炎与非萎缩性胃炎之间有1 331个明显差异表达基因；GSE83389数据集中，萎缩性胃炎与异型增生之间有1 506个明显差异表达基因；GSE106656数据集中，萎缩性胃炎与非萎缩性胃炎之间有979个明显差异表达基因。不同数据集中前五位差异表达基因见表1。

表1 不同数据集中位列前5位的差异表达基因

二、 “非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”差异表达基因的验证

采用GSE116312数据集对“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病链中明显差异表达基因进行验证，结果显示5个基因在GSE116312中存在与原数据集相同调控方向的差异表达(图1)。

图1 GSE2669、GSE106656和GSE27411数据集中“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”差异表达基因在GSE116312中的验证

三、炎性细胞表型特征基因分析

共筛选出85个炎性细胞表型特征基因，所属炎性细胞分别为成纤维细胞、中性粒细胞、神经元细胞、NK细胞、巨噬细胞、B细胞、树突细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、内皮细胞。巨噬细胞在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病链中的比例均较高，分别为24.5%和22.2%。在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎”中，中性粒细胞比例为30.6%；在“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”中，成纤维细胞和巨噬细胞比例分别为25.0%和22.2%(表2)。

表2 炎性细胞表型特征基因在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病动态链中的比例n(%)

四、“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”差异表达炎性细胞表型特征基因的富集通路

REACTOME和KEGG通路分析显示，在“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病链中，差异表达基因主要富集于免疫过程，分别为IL-10、IL-4和IL-13信号通路以及抗原处理与呈递信号通路(表3)。

表3 “非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病动态链中差异表达炎性细胞表型特征基因的通路富集分析

五、PPI网络

PPI网络分析显示，GSE27411数据集中包含8个基因，分别为KIF20A、KIF2C、CENPE、NUSAP1、ACP5、COL1A1、FCGR1A和C5AR1；而GSE106656数据集PPI网络中包含GSE27411的8个基因，以及另外15个基因(图2)。

A：数据集GSE27411；B数据集GSE106656

讨 论

在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”的疾病动态变化过程中，炎性细胞的种类和数量变化蕴含着非常丰富的生物学信息。本研究对GEO数据库中全部可获得的胃癌癌前状态的信息进行分析，纳入了包含“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎-异型增生”变化过程的共计4个数据集，结果发现了逾千个差异表达基因，并与GSE116312数据集进行验证，共发现了5个共同差异表达基因。进一步分析炎性细胞特征表型基因发现，在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎”疾病链中，中性粒细胞比例较高(30.6%)，而“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病链中，成纤维细胞比例较高(25.0%)。中性粒细胞的主要功能为细胞的吞噬和消化，是机体发生炎症反应时最先被招募至损伤位置的细胞，能通过释放杀菌蛋白、细胞因子和活性氧等物质发挥作用，是活动性胃炎的主要效应分子。有研究显示，肿瘤微环境中浸润的中性粒细胞能削弱T细胞免疫，促进胃癌的发展[8-9]。在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎”动态变化中，中性粒细胞是否发挥类似作用成为促炎因素，还有待进一步探索。成纤维细胞的主要功能为细胞修复。非萎缩性胃炎发展成为萎缩性胃炎时，胃黏膜变薄，固有腺体减少，是胃黏膜因各种原因导致损伤的进一步表现，可能与成纤维细胞增多相关。有研究[10-11]证实胃异型增生微环境中的成纤维细胞能分泌癌细胞恶化所需的微环境因子，如Wnt5A等，从而发挥促肿瘤作用。说明成纤维细胞作为肿瘤微环境中的一员，具有促进、维持肿瘤细胞恶性表型的作用。

本研究发现巨噬细胞在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”的疾病动态变化中的比例均较高，分别为24.5%和22.2%。说明巨噬细胞在疾病变化全程中可能均发挥重要作用。在肿瘤微环境中，肿瘤相关巨噬细胞扮演重要角色[12-14]，能通过分泌细胞因子促进肿瘤细胞增殖、迁移[14-17]。Lin等[18]发现，巨噬细胞分泌的CXCL8与CD8+T细胞浸润减少有关，CXCL8通过作用于巨噬细胞，可减少巨噬细胞表达PD-L1，进而抑制CD8+T细胞的功能，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。本研究发现巨噬细胞在胃黏膜微环境炎性细胞中的比例较高，但其是否是易于癌变胃炎的特征以及其在癌变中的功能仍未明确，有待进一步探索。

本研究进一步行炎性细胞表型特征差异表达基因的富集通路分析，在“非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”疾病链中，多种与免疫活动相关的代谢通路发生了变化，主要富集于IL-10、IL-4和IL-13信号通路、抗原处理与呈递信号通路等。IL-10是一种多细胞源、多功能的细胞因子，参与炎性反应和免疫反应，是公认的炎症和免疫抑制因子，能抑制单核巨噬细胞的抗原递呈作用[19-21]。Zhang等[22]的研究显示分泌IL-10的巨噬细胞表型在多种肿瘤类型中发挥促进免疫逃逸的作用，并与胃癌患者预后差有关。由此可见，IL-10信号通路和巨噬细胞在肿瘤形成以及癌前状态中均发挥重要作用，并可能是某些特定炎症易于癌变的重要原因，有待后续研究进一步阐述。 IL-4和IL-13在一定程度上分享共同的受体和信号通路，是导致过敏反应的关键性细胞因子[23]。IL-4和IL-13能增强结肠癌细胞的活性，可能与肿瘤生长有关[24]。本研究显示IL-4和IL-13信号通路可能在胃癌癌前状态中起有作用。同时，抗原处理与呈递信号通路的改变也是特定胃炎易于癌变的重要原因，有待后续研究的进一步探索。

PPI网络的构建发现了8个比较重要的差异表达基因，其中4个基因构成了一个比较重要的网络(KIF20A-KIF2C-CENPE-NUSAP1)。在这4个基因中，KIF20A和KIF2C均为驱动蛋白家族成员；CENPE为着丝粒蛋白，是一个与细胞周期相关的驱动蛋白样分子；NUSAP1与纺锤体的形成有关。PPI网络的构建显示在非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎的变化过程中，细胞周期相关蛋白的相互作用可能发挥重要功能。

总之，本研究结果显示，在“正常胃黏膜-非萎缩性胃炎-萎缩性胃炎”的疾病动态链中存在多种差异表达基因。相对于非萎缩性胃炎而言，萎缩性胃炎更倾向于癌变可能与微环境中炎性细胞表型特征基因的改变有关，成纤维细胞和巨噬细胞可能发挥了重要作用；IL家族信号通路以及抗原处理与呈递信号通路亦可能发挥了重要作用。但本研究结论仍需行进一步研究证实，从而有助于胃癌发病的防控。