一例犬细小病毒与圆环病毒混合感染的诊断报告

冯帆，卢建远，黄坚，汤承

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

犬腹泻是宠物犬最为常见的疾病之一，细菌、寄生虫和病毒是致犬腹泻的三种主要病因。病毒性犬腹泻是非免疫犬死亡的重要原因[1]，犬细小病毒2 型（CPV-2）、犬冠状病毒（CCoV）和犬瘟热病毒（CDV）是宠物犬中最常见的病毒性肠道病原体[2]。近年来的研究显示，犬圆环病毒（CanineCV）、犬星状病毒（CAstV）等新发病毒也是致犬腹泻的重要病原。目前，多种病毒的混合感染已十分常见，不仅加大了临床兽医对犬病毒性腹泻的诊断难度，而且常常会增加疾病的严重程度，从而增加治疗难度。CanineCV 于2012 年首次在美国被发现[3]，该病毒可引起犬急性腹泻、呕吐等症状，并且该病毒可能与宿主免疫抑制有关[4-5]，国内关于CanineCV病例的报道很少。本文对接诊的一例腹泻犬进行了犬细小病毒、犬冠状病毒、犬瘟热病毒、犬圆环病毒、犬星状病毒5 种犬腹泻病毒的PCR 检测，以确诊引发腹泻的病原，现报告如下：

1 病犬基本情况

2018年12月，在动物医院接诊了一只6月龄雌性博美犬，体重为2.90 kg。该犬疫苗接种情况为：首免使用英特威二联疫苗，第二、三、四次免疫使用英特威四联苗及狂犬病疫苗。发病时间距最后一次免疫接种完成有30 d。就诊前一日该犬出现呕吐，由最初吐出食物到最后吐出白色带泡沫的黏液，之后出现拉稀、血便。

2 临床症状

体温40.3 ℃（犬正常体温为38.0～39.5 ℃），精神沉郁，呕吐频繁，鼻汗少，便血并带有腥臭味，可视黏膜苍白，被毛凌乱，喜卧。

3 5种致犬腹泻病毒的PCR检测

3.1 样本采集及核酸提取 使用无菌棉签蘸取适量粪便样本于采样管中，加入PBS 缓冲液，按照1∶5的比例稀释，涡旋振荡5 min，置于4 ℃离心机中以12 000 r∕min 离心15 min。离心后取上清液于新的1.5 mL EP管中，采用酚-氯仿法提取样本中的总DNA，采用Trizol 法提取样本中的总RNA，并反转录成cDNA。采用文献报道的检测方法，对CPV-2、CCoV、CDV、CAstV 和CanineCV 5 种病毒进行PCR 检测，引物由上海生工生物公司合成，引物信息见表1。

表1 PCR扩增引物信息

PCR 反应体系为25 μL：2×rTaq PCR PreMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 或cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保存。反应结束后，取PCR 产物10 μL 用1.5%琼脂糖凝胶电泳（120 V，30 min），观察结果并拍照。

3.2 PCR 检测结果 CCoV、CDV 和CAstV 均为阴性，CPV-2 和CanineCV 为阳性，部分检测电泳图见图1、图2。

图1 CPV-2 PCR检测凝胶电泳图

图2 CanineCV PCR检测凝胶电泳图

4 诊断结果

根据临床检查和PCR检测结果，诊断该患病犬为CPV-2和CanineCV的混合感染。

5 结论与讨论

本试验对病犬进行了CPV-2、CCoV、CDV、CAstV和CanineCV 5种病毒的特异性PCR检测，结果显示为CPV-2 和CanineCV 的混合感染，排除了其他3种病毒的感染。目前国内对于犬腹泻病原的诊断常限于CPV-2、CCoV 和CDV 等常见病原，对于新发病毒的检测还重视不够。本实验室前期对四川省犬腹泻粪便样本的调查结果显示：CanineCV 和CAstV 的检出率分别为15.4%（32∕208）和39.3%（42∕107）[11]，因此对新发犬腹泻病毒的检测值得关注。

最近的研究显示，CanineCV 常 与CPV-2 共同感染，在肠道疾病中起协同作用，从而导致临床症状加重；或者在其他病原体损伤宿主肠道上皮细胞和淋巴细胞后，CanineCV致病性发生变化，从而加重病情[12]。2016年，孙文超等[13]首次在中国大陆从犬血清样品中检测出CanineCV病毒。2018年，严楠等[11]对四川省部分地区宠物医院的犬腹泻样本进行CanineCV 荧光定量PCR 检测，检出率为15.4%（32∕208）。目前可以确定的是，CanineCV 可导致犬出现脉管炎、坏死性淋巴结炎等。美国于2016年、德国于2017年分别报道了CanineCV 与CPV-2混合感染导致犬急性出血性腹泻和急性死亡的病例[12，14]。

CPV-2 能够引起患犬急性肠炎、白细胞减少、呕吐及幼犬的心肌炎等病症。该病一年四季皆可发生，以发病急、病程短、传染性强、死亡率高为特点，是危害我国养犬业最为严重的传染病之一。目前对该病毒的防控主要以疫苗为主，商品化的CPV-2疫苗已有不少，即使使用了CPV-2疫苗进行免疫，也仍有可能出现CPV-2感染。免疫失败的原因可能是疫苗方面的原因，如疫苗使用不当、流行毒株发生变异与疫苗毒株不匹配等；也有可能是免疫犬自身的原因，如营养不良、寄生虫感染、患有免疫抑制性疾病等[15]。这些因素都会使CPV-2 的免疫接种不可靠，这对CPV-2的防控提出了新的考验。有趣的是，本次接诊的患犬根据其免疫记录可知其已经过4次疫苗免疫，其发病时间距最后一次免疫接种完成仅有30 d，即使接种了CPV-2 疫苗，也仍然出现了CPV-2 感染。虽然无法确定两种病毒感染的先后顺序，但该犬存在感染CanineCV后自身出现免疫抑制，最后造成CPV-2感染的可能性。这也提醒我们有必要将CanineCV 作为犬腹泻病原诊断的一个重要检测项目。