一株新型抑制细菌性阴道病的菌种鉴定

龚 莉，蒋 彬，许少燕，陈贵浩，林 敏，杨培奎，王锦旭，郑玉忠，陈滋凯*

（1. 广东龙创基药业有限公司，广东 潮州 521000；2. 广东强基药业有限公司，广东 潮州 515636；3. 韩山师范学院 食品工程与生物科技学院，广东 潮州 521041）

细菌性阴道病（Bacterial vaginosis，BV）是育龄期妇女常见阴道感染性疾病，发病率通常占整个妇女人群的10%～29%左右.BV是阴道微生态紊乱引起的感染性疾病，其临床主要表现为阴道酸性环境改变，pH升高，乳杆菌明显减少或缺失，阴道致病菌大量繁殖.

目前用于治疗阴道疾病的常规疗法多采用甲硝唑、替硝唑、克林霉素等抗生素治疗.而抗生素在抑制杀灭病原菌的同时也抑制了阴道正常菌群的生长，未从根本上恢复阴道微生态平衡，容易导致BV 复发.此外，抗生素治疗副反应较大，同时也容易导致细菌产生耐药性，为治疗带来新的挑战.而采用益生菌定植进入阴道中不仅可有效治疗细菌性阴道病，改善种群失调，而且副作用较小.乳杆菌是常用的定植菌种，其作用机制是粘附在人体上皮细胞后在阴道内环境中大量繁殖，其代谢分泌物（主要为乳酸）等抑菌物质可抑制致病菌的生长，并最终使阴道内环境恢复正常［1-2］.

为了获得具有治疗细菌性阴道病潜质的菌种，我们从健康人阴道分泌物中分离获得一株优势乳杆菌（RD-0046），经过鉴定为格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri）.实验结果表明，RD-0046对典型厌氧阴道致病菌的抑菌能力明显优于上市品定君生（德氏乳杆菌，RD-0001），并且对常规好氧致病菌也有较强的抑制作用；另外，RD-0046对阴道上皮细胞（VK2/E6E7）具有与RD-0001相当的粘附能力.总而言之，本文的研究发现一株新型的具有较强抑菌功能的乳杆菌，有助于开发治疗细菌性阴道病的药物.

1 材料和方法

1.1 细菌的分离培养

将健康女性阴道分泌物在MRS 培养基中37 ℃恒温培养，通过培养基的碳酸钙溶解圈和划线传代、产酸能力和产过氧化氢能力评价、以及工业化耐冷耐热筛选等，最终筛选分离获得乳杆菌（RD-0046）.

1.2 进化树分析

利用ClustalX 和MegaX 对RD-0046 进行进化树分析［3］.用最大可能性法（Maximum likelihood method）和普遍时间可逆模型（General time reversible model）［4］推断进化历史，相关分类群聚集的树的百分比显示在树枝旁边.通过将临位相连算法（Neighbor-Join and BioNJ algorithms）应用到成对距离矩阵，采用最大组合可能性（Maximum composite likelihood）方法估计，然后选择最佳对数可能性值的拓扑，自动获得启发式搜索的初始树.用离散伽马分布来模拟不同位点［5 个类别（+G，参数0.2626）］的进化率差异.该模型允许某些位点在进化上是不变的（+I，49.42%位点）.

1.3 抑菌实验

采用牛津杯法，以上市品定君生（德氏乳杆菌，Lactobacillus delbrueckii，RD-0001）为参照，考察目标菌RD-0046对典型厌氧阴道致病菌（阴道加德纳氏菌和阿托波菌）的抑菌能力.另外，检测对常见好氧型致病菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、变形杆菌和白色念珠菌）的抑菌能力.

1.3.1 阿托波菌抑菌实验

阿托波菌在琼脂斜面活化后培养两代，用无菌水洗下菌团，取菌液均匀涂布于杜克雷嗜血杆菌培养基［5］；同时活化乳杆菌24 h后与55 ℃MRS固体培养基混合，冷却固化，37 ℃厌氧培养24 h.打孔形成菌饼，将菌饼置于致病菌培养基上共同培养，37 ℃严格厌氧培养2～4 d，待阿托波菌明显生长后观察抑菌圈形态、量取抑菌圈大小.

1.3.2 阴道加德纳氏菌抑菌实验

阴道加德纳氏菌在BHI培养基（脑心浸出液肉汤培养基，临用前加入5%无菌马血清）中37 ℃厌氧培养至明显混浊，菌液用PBS稀释至10×和100×两个稀释度.将含有0.6%琼脂的BHI半固体培养基水浴加热使融化，降温至45～50 ℃，加入5%无菌马血清，再加1 mL阴道加德纳菌稀释液混匀，倒入培养皿凝固.乳杆菌按1.3.1的方法制备菌饼，将菌饼置于致病菌培养基上共同培养，37 ℃严格厌氧培养48 h，待阴道加德纳氏菌明显生长后观察抑菌圈形态、量取抑菌圈大小.

1.3.3 好氧型致病菌抑菌实验

大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、变形杆菌使用胰酪大豆胨液体（TSB）培养基，33～35 ℃有氧培养12～24 h，生长明显后，用无菌生理盐水稀释液稀释10×和100×两个浓度.与50 ℃TSB固体培养基混合凝固后获得带菌平皿.白色念珠菌使用沙氏葡萄糖液体（SDB）培养基，23～25 ℃培养48～72 h，生长明显后，用无菌生理盐水稀释液稀释10×和100×两个浓度.与50 ℃SDB固体培养基混合凝固后获得带菌平皿.乳杆菌按1.3.1的方法制备菌饼后与致病菌共同培养.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、变形杆菌在33～35 ℃有氧培养12～18 h.白色念珠菌在23～25 ℃培养48～72 h至菌落明显生长后，观察抑菌圈形态、量取抑菌圈大小.

1.3.4 细胞粘附实验

将乳杆菌RD-0046和RD-0001分别进行培养，然后再与VK2/E6E7人阴道上皮细胞共同孵育2 h，培养结束后清洗未粘附的细菌，然后用Triton X-100裂解细胞，制成混悬菌液，计数得到粘附的细菌数量，除以细胞总数得到平均每个细胞粘附的细菌数量，共开展两次平行试验.

2 实验结果

2.1 RD-0046菌种的鉴定

RD-0046单菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，较扁平，半透明.染色镜检呈蓝色，细杆状，末端钝圆，呈细丝状排列.接触酶和氧化酶实验为阴性反应，糖发酵实验和V-P实验显红色.

鉴定菌种使用的测序引物序列如下：

27F 5‘ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3’（M=C：A）

1492R 5‘ TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3’（Y=C：T）

本文对RD-0046进行了细菌基因组提取，通过16S rDNA通用引物27F和1492R［6］测序并成功完成了菌种鉴定，鉴定参考物种结果为格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri，序列号：KX673998.1）.根据拼接序列（图1A）构建乳杆菌属细菌的进化树，RD-0046所在位置见图1B.

图1 RD-0046的鉴定和分类

2.2 RD-0046的抑菌作用

牛津杯法检测结果表明格氏乳杆菌RD-0046 对典型厌氧阴道致病菌（阴道加德纳氏菌和阿托波菌）具有抑制作用，并且其抑制能力高于RD-0001（图2A，图2B）.另外，格氏乳杆菌RD-0046对常见好氧型致病菌（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、变形杆菌和白色念珠菌）也具有明显的抑制作用（图2C）.

图2 RD-0046的抑菌作用

2.3 RD-0046的细胞粘附

乳杆菌是常用的阴道定植菌种，其作用机制是粘附人体上皮细胞上并且在阴道大量繁殖，其代谢分泌物（主要为乳酸）等抑菌物质可抑制致病菌的生长，并最终使阴道内环境恢复正常［1-2］.乳杆菌RD-0046和RD-0001 与人阴道上皮细胞VK2/E6E7 均有较好的粘附能力.结果表明单个VK2/E6E7细胞粘附德氏乳杆菌约6.7～8.6个，粘附RD-0046约8.5～11.7个，RD-0046体外细胞粘附能力略优于德氏乳杆菌（图3）.基于细胞的粘附原理，说明格氏乳杆菌RD-0046能有效进行粘附，为阴道定植起效奠定了基础.

图3 RD-0046在VK2/E6E7细胞的粘附试验

3 讨论

传统的牛津杯法（菌饼法）是考察乳杆菌菌株的抑菌能力的通用方法［7-8］.其原理是基于抑菌物质可以在琼脂平板上向四周梯度扩散的现象，故将抑菌物质装载于牛津杯（上下开口的圆柱形不锈钢小桶）中，而后扩散于抑菌平板，可对扩散部位的细菌产生生长抑制作用，并形成规则圆圈（称抑菌圈），可通过抑菌圈大小来判断抑菌生长的能力.由于乳杆菌分泌物能够有效抑制致病菌的生长，故可采用乳杆菌的菌饼在抑菌平板上产生抑菌圈［7-8］.

细菌性阴道病的发生不是因为乳杆菌完全消失，而是由于厌氧菌的过度生长导致微环境内细菌平衡关系被打破［9］，生殖道的感染危害极大，严重时会导致女性不孕［10］.阿托波菌是细菌性阴道病的特征致病菌［11-12］，其单独阳性是诊断的特异性和敏感度都在80%以上［13］.阴道加德纳氏菌是引发非特异性阴道炎常见的重要病菌［14］.因此，选用这两种厌氧菌作为抑菌实验的致病菌.

由于乳杆菌和阴道加德纳氏菌和阿托波菌等致病菌的体外生长条件存在差异，因此将乳杆菌和致病菌分别在各自适宜的培养基上培养生长，然后再放置在同一平板上在共同生长的过程中判断相互抑制能力.阿托波菌在液体培养基中生长较为困难，细菌浓度较大时在琼脂面上更容易生长，因此用琼脂斜面扩增生长的致病菌直接刮取后进行抑菌考察.

RD-0046菌株对常见的好氧致病菌均有抑制能力，由于这些好氧致病菌并非细菌性阴道病的常规致病菌，故仅为抑菌实验的常规考察，未与上市品进行对比试验.

通过乳杆菌与细胞的混合孵育后细胞上黏附的乳杆菌数量确定细菌与细胞的黏附能力，通常黏附数量越多则黏附能力越强，预期药效更好.RD-0046菌株来源于阴道分泌物，拟用于治疗阴道疾病，因此选用人阴道上皮细胞VK2/E6E7 作为粘附实验的细胞［15］.实验结果表明RD-0046 具有与上市品RD-0001 相当的粘附效果.后续研究将通过大鼠、食蟹猴等动物模型的定植实验，进一步评价RD-0046在体内的急性毒性、长期毒性、抑菌效果、定植效果等方面的反应，开发RD-0046的临床应用价值.

4 结论

本研究分离的菌株RD-0046经鉴定属于格氏乳杆菌，对阴道有害厌氧菌和常见的好氧菌有较强的抑菌作用，并且对阴道上皮细胞有很好的粘附，有助于开发治疗细菌性阴道病的药物.