胡桃醌通过调节CDK4表达调控口腔鳞癌Tca8113细胞增殖和凋亡

吴建安， 尚 厦， 胡 倩

(湖北中医药高等专科学校， 湖北 荆州 434020)

口腔癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，在头颈部恶性肿瘤发病率仅次于鼻咽癌。在所有口腔癌患者中，口腔鳞状癌(OSCC)是主要的组织病理学类型，超过90%[1]。口腔癌的发病机制很复杂，例如吸烟、饮酒、病毒感染、营养不良和不良饮食习惯[2]。周期蛋白依赖性激酶4(CDK4) 的生成为细胞 G1期进展所必需，并控制该期进展速率的表达[3]。许多研究表明[4]，CDK4与口腔鳞状癌在内的多种恶性肿瘤中过度表达有关，口腔鳞状癌组织中CDK4水平下降，与口腔癌患者的生存率和预后有关，这意味着CDK4表达水平是治疗癌症的理想靶点。因此，对CDK4表达水平有抑制的药物可能是癌症治疗的一个强有力的治疗选择，包括口腔鳞状癌。随着癌症治疗声音的不断增加，抗癌药物的研究已成为许多科学家的研究对象，胡桃醌存在于胡桃属植物中，如核桃树叶、树皮、青果皮等。在中国民间流传其可用于治疗胃癌、肝癌、肺癌和其他类型的癌症。据报道，胡桃醌可抑制大鼠中氧化偶氮甲烷诱导的肠癌发生，可能是人类肠道肿瘤中一种很有前途的化学预防剂。胡桃醌在最近的研究中也被证明对一些肿瘤细胞具有抗增殖和凋亡的活性，包括肉瘤腹水细胞、胃癌、结肠癌、表皮样癌、白血病和前列腺癌[5]。然而，有关胡桃醌治疗口腔癌的分子机制和化疗潜力的研究却很少。本研究以人口腔鳞癌细胞系Tca8113为实验模型，观察胡桃醌的抗增殖作用和凋亡诱导活性，并对其可能的分子机制进行了阐述，特别是CDK4表达水平的研究。本研究将为进一步了解胡桃醌在口腔鳞癌防治中的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1细胞系:人口腔鳞癌Tca8113细胞购自中国科学院细胞库，批号20180113。

1.1.2主要试剂与仪器:胡桃醌购自上海友思生物技术有限公司，批号20171127；DMEM培养基购自瑞士Lonza公司，批号AH0478；胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素购自美国Gibco公司，批号CK1357、CK3619；流式细胞仪凋亡检测试剂盒和兔抗人CDK4多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号20171209、20180207；四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚矾(DMSO)购自美国Sigma公司，批号ab0617、ab0729；BD FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司；Nunc细胞培养板为美国Gibco公司；EVOS M5000倒置显微镜为日本奥林巴斯公司；K3酶标仪为奥地利Tecan公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养:将人口腔鳞癌Tca8113细胞维持在含有10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素的DMEM培养基中。在37℃和5%CO2中培养，每天观察细胞的形状和数量、培养液的颜色和透明度，每3天更换一次培养液。当细胞生长达到80%以上时，采用0.5%胰蛋白酶进行消化传代。当体积减小时，用含10%犊牛血清的培养液终止消化，轻轻吹入单细胞悬浮液。在37℃，5%CO2的培养箱中培养，对数期的细胞用于实验。

1.2.2胡桃醌培养液的配置以及实验分组:首先将胡桃醌以1mmoL/L的浓度溶解于新制备的培养基中形成母液，然后过滤灭菌，然后稀释，制备浓度为25μmoL/L、50μmoL/L、100μmoL/L的试验溶液。将培养好的细胞分为对照组(0μmoL/L)、胡桃醌低剂量组(25μmoL/L)、胡桃醌中剂量组(50μmoL/L)、胡桃醌高剂量(100μmoL/L)，实验组用相应浓度的胡桃醌培养液培养细胞，对照组用等体积的DSMO培养。以上各组每孔设6个平行样，培养24h。

1.2.3胡桃醌作用后Tca8113细胞的形态学观察:通过用胰蛋白酶消化对数生长期的Tca8113细胞制备细胞悬浮液，将细胞悬浮液加入到6孔板的每个孔中，置于37℃，5%CO2培养箱中培养至细胞贴壁。实验组分别加入不同浓度的胡桃醌溶液，对照组加相同体积的培养液，在培养箱中培养24h之后，取出6孔板以在倒置显微镜下观察细胞的生长形态并拍照。

1.2.4MTT法检测Tca8113细胞增殖情况:将对数生长期Tca8113细胞用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，接种到96孔培养板上，每孔120μL。细胞贴壁后，分别加入已配制的不同浓度的胡桃醌溶液，使其浓度分别为0、25、50、100μmoL/L，每种药物浓度设置6个复制孔。以0μmoL/L胡桃醌为对照组。培养24h后，将浓度为5g/L的MTT(20μl)添加到每个孔中。在黑暗中孵育4h，丢弃上清液，向每个孔中加入DMSO(150μl)，振荡10min，直至紫色浮渣完全溶解，用酶标仪测量490nm处的吸光度(OD)值。

1.2.5流式细胞仪检测Tca8113细胞的凋亡率:收集各处理组培养24h的细胞，通过胰蛋白酶消化后制备成细胞悬浮液，并用PBS洗涤两次，将细胞在4℃下70%乙醇中固定过夜，随后加入含RNA酶的PI染液染色30min，最后上机检测，并用配套软件对数据进行处理。

1.2.6细胞免疫化学法检测CDK4的表达:将高压消毒的盖玻片逐个放入孔培养板内，将经胰酶消化制成悬液的细胞接种到底部铺有盖玻片的培养板内，置入培养箱培养。待细胞贴壁后加入不同浓度的胡桃醌溶液，孵育24h后用70%乙醇固定，取出盖玻片，将细胞面朝上，快速取出并转移到PBS缓冲液中洗涤3次，严格按照通用型SP试剂盒说明书操作，完成CDK4的细胞免疫化学染色。染色后在显微镜下计数1000个细胞中的阳性细胞数，得出阳性细胞率，用PBS代替一抗做阴性对照，以确定染色特异性。

2 结 果

2.1Tca8113细胞的形态学观察:在倒置显微镜下，对照组细胞可见其贴壁生长良好，细胞形态呈纺锤形或多角形，胞质丰富，细胞核位于细胞中央。加入胡桃醌溶液后，随着胡桃醌浓度的增加，可见细胞数量减少，细胞质粗糙，颗粒积聚在其中，细胞变得更小和圆润，失去附着力并从附着物上脱落。胡桃醌浓度越高，变化越明显。见图1。

图1 各组Tca8113细胞形态学的比较(HE染色，×400)

2.2胡桃醌对人口腔鳞癌Tca8113细胞增殖的影响:胡桃醌对Tca8113细胞的增殖具有明显的抑制作用，且与浓度有关。胡桃醌低、中、高剂量组Tca8113细胞OD值均低于对照组，差异有统计学意义(t=2.894、6.352、7.741，均P<0.05)；胡桃醌中、高剂量组Tca8113细胞OD值低于胡桃醌低剂量组，差异有统计学意义(t=4.975、6.136，均P<0.05),见表1。

表1 胡桃醌对Tca8113细胞增殖抑制的影响

注:与对照组比较，aP<0.05；与胡桃醌低剂量组比较，bP<0.05

2.3流式细胞仪测定Tca8113细胞的凋亡率:胡桃醌高、中、低剂量组细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(t=6.427、14.032、21.553，均P<0.05)；胡桃醌高、中剂量组细胞凋亡率高于胡桃醌低剂量组，差异有统计学意义(t=8.642、15.085，均P<0.05)；胡桃醌高剂量组高于胡桃醌中剂量组，差异有统计学意义(t=9.261，P<0.05),见表2。

2.4胡桃醌对CDK4表达的影响:胡桃醌高、中、低剂量组CDK4阳性率明显低于对照组，差异有统计学意义(t=6.586、17.375、24.462，均P<0.05)；胡桃醌高、中剂量组CDK4阳性率低于胡桃醌低剂量组，差异有统计学意义(t=10.789、16.876，均P<0.05)；胡桃醌高剂量组CDK4阳性率低于胡桃醌中剂量组，差异有统计学意义(t=6.089，P<0.05),见表3。

表2 不同浓度胡桃醌对Tca8113细胞凋亡率的影响

注:与对照组比较，aP<0.05；与胡桃醌低剂量组比较，bP<0.05；与胡桃醌中剂量组比较，cP<0.05

表3 胡桃醌对Tca8113细胞CDK4表达阳性率的影响

注:与对照组比较，aP<0.05；与胡桃醌低剂量组比较，bP<0.05；与胡桃醌中剂量组比较，cP<0.05

3 讨 论

口腔鳞癌是一种侵袭上皮的恶性肿瘤，是当今世界上第六大最常见的肿瘤，尽管口腔鳞癌的诊断和综合治疗取得了进展，但在过去的二十年内，其5年生存率仍只有60%[6,7]。另外，由于面部变形和功能障碍，手术后患者的生活质量较差，迫切需要新的有效的预防和治疗口腔鳞癌的药物。

近年来的研究表明[8,9]，醌在自然界中广泛分布，具有许多生物学功能，可做抗菌剂、杀菌剂、抗疟药和抗癌药，醌的生物效应很大程度上是通过氧化还原活性形成活性氧以及游离硫醇共价修饰形成硫醚来实现的。胡桃醌是一种强效细胞毒剂，其细胞毒性基于其与氧的高反应性，并且经常用作自由基增强剂。Song[10]的实验结果表明，胡桃醌在各种肿瘤细胞系中诱导细胞周期停止和凋亡，但对人头颈癌生长的影响的研究很少。因此，本研究调查了胡桃醌对人口腔鳞癌Tca8113细胞生长的影响，以进一步阐述其抑制增殖途径。本研究我们采用MTT法来定量检测胡桃醌对Tca8113细胞的增值抑制作用，结果表明，胡桃醌能有效抑制Tca8113细胞的增殖活性，且随着浓度的增加，抑制增殖作用越明显。同时本实验通过流式细胞实验检测不同浓度胡桃醌均有诱导细胞凋亡的作用，浓度越高，作用越强，说明胡桃醌可以诱导Tca8113细胞的凋亡。两项实验研究结果均清楚地表明胡桃醌对Tca8113细胞生长的影响，表明胡桃醌可能是潜在的口腔鳞癌预防和治疗药物。

有报道[11～13]指出某些抑癌基因和癌基因在口腔癌的发展中出现了异常表达，其中最突出的两个基因是视网膜母细胞基因和p53基因，其中包括CDK4在内的几种视网膜母细胞基可以调控不同细胞周期的转换。而细胞循环周期失控可导致异常的细胞增殖和肿瘤形成，有研究发现CDK4在舌癌中的阳性表达率为61.5%，显著高于正常舌粘膜[14]，提示了CDK4与舌癌的增殖密切相关。本实验测定不同浓度胡桃醌作用下Tca8113细胞中CDK4的阳性表达率，对胡桃醌的促凋亡机制进行进一步观察，结果显示胡桃醌有下调CDK4表达的作用，且胡桃醌浓度越高，对CDK4阳性表达率下调的作用越显著，说明胡桃醌可能是通过调控CDK4的表达从而起到调控Tca8113细胞增殖和凋亡作用。

综上所述，胡桃醌可抑制口腔鳞癌Tca8113细胞的增殖活性，诱导细胞凋亡，下调CDK4的阳性表达率，抑制肿瘤的侵袭，提示胡桃醌在预防和治疗口腔鳞癌方面具有潜在的临床研究价值。