旱柳根系细胞壁多糖和抗氧化系统对镉的响应

曾小仪，庞 璐，陈韵如，田兴军

(南京大学生命科学学院，江苏 南京 210023)

1 材料与方法

1.1 实验材料与设计

用于水培的旱柳插条(直径1.0 cm，长度15 cm)于2018年3月采自江苏省宿迁市。50 μmol/L Cd处理旱柳，生长会受到明显抑制但不致死，在100 μmol/L Cd处理条件下生长受到严重抑制，多数个体致死(未发表数据)。因此，本实验处理设置为：0 μmol/L(Control，对照)，25 μmol/L(Cd25，低浓度Cd处理)，75 μmol/L(Cd75，高浓度Cd处理)。插条在Hoagland 营养液中培养。培养条件：光照/黑暗时间为14/10 h，白天/黑夜的温度为25/20 ℃。营养液持续通气，每隔5 d更换营养液。插条用无Cd营养液预培养3周后，向营养液中加入一定浓度的CdCl2继续培养5周。

1.2 植物生长测定及样品预处理

8周培养结束后，测量最长茎长和最长根长，称量新枝(新生枝叶)和根系鲜重。新枝和根系在70 ℃条件下烘干72 h后测干重。取新鲜根系置于20 mmol/L EDTA-Na2中浸泡20 min(以交换掉根系表面的Cd)，用超纯水洗涤并晾干。新鲜叶片与根系在液氮中充分研磨成粉末后，-80 ℃保存备用。

1.3 根系细胞壁的提取

参考Zhong等[22]的方法，并根据Zhu 等[23]和Chen等[24]的方法稍作改动。以根系粉末(g)和提取液(mL)为1∶80的比例用75 %乙醇提取，提取液与根系材料在冰水浴条件下反应20 min，离心(10 000 r/min, 20 min, 4 ℃)去除上清。获得的沉淀依次加入丙酮，三氯甲烷∶ 甲醇(1∶1)和甲醇按照同样的方法提取(所有提取液均4 ℃预冷)。提取完成后的细胞壁冻干后于4 ℃密封保存备用。

1.4 植株及根系细胞壁Cd含量的测定

新鲜根系用EDTA-Na2溶液浸泡，超纯水洗涤并晾干。新枝与根系于70 ℃下烘干72 h，磨碎。称取烘干研磨后的新枝、根系和1.3中提取的根系细胞壁各0.05 g，用HNO3/H2O2进行消解(USEPA Method 3050B)，然后用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS; NexION300X, PerkinElmer)测定Cd含量[25]。

1.5 根系细胞壁多糖的提取及其含量的测定

参考Zhu等[8]和Dai等[12]的方法分离果胶和半纤维素。称取2 mg细胞壁，加入1 mL去离子水在沸水浴中提取1 h，离心(12 000 r/min, 20 min, 4 ℃)取上清，重复提取3次，合并上清，即果胶样品液。提取果胶后的沉淀加入1 mL 4 %(w/v)KOH[含有0.02 %(w/v)KBH4]，25 ℃下反应12 h，离心取上清，重复提取2次，合并上清，即HC1样品液。提取HC1后的沉淀，用24 %的KOH[含有0.02 %(w/v)KBH4]提取，提取方法同HC1，即HC2样品液。样品液于4 ℃保存备用。

参考Zhu等[23]和Blumenkrantz等[26]描述的方法用果胶中的半乳糖醛酸含量来表征果胶含量。取200 μl果胶样品，加入1 mL 98 %的H2SO4(含有0.0125 mol/L Na2B4O7·10H2O)，在沸水浴中反应5 min。冷却恢复至室温后，向溶液中加入20 μl 0.15 %的间羟基联苯(M-hydro-diphenyl)，25 ℃反应20 min，测定520 nm处的吸光度。参考Yang等[27]和Zhu等[8]描述的方法用半纤维素中的葡萄糖含量来表征半纤维素含量。取200 μl半纤维素样品，加入1 mL 98 % H2SO4和10 μl 80 %苯酚，在室温下反应15 min。然后在沸水浴中反应15 min。冷却恢复至室温后，测定490 nm处的吸光度。

1.6 根系PME活性测定

参考Xu等[28]和Dai等[12]的方法测定PME活性，取0.2 g根系粉末加入1 mL PME提取液(含0.1 mol/L柠檬酸、0.2 mol/L Na2HPO4、1 mol/L NaCl，pH 5.0)，在4 ℃条件下提取1 h，离心(12 000 r/min, 10 min, 4 ℃)取上清，即PME样品。然后向50 μl PME样品中加入1 mL PME反应液[含0.5 %(w/v)柑橘果胶，0.2 mol/L NaCl和0.015 %(w/v)甲基红，pH 6.8]，在37 ℃下反应2 h，测定525 nm处的吸光度。

1.7 氧化胁迫指标的测定

CAT活性测定采用CAT检测试剂盒(紫外比色法，Leagene, Beijing, China)，CAT样品液与H2O2基液反应，每隔1 min测定OD240的值，计算CAT活性。POD和SOD用磷酸缓冲液提取，其活性测定分别参考Liu等[31]和Aravind等[32]的方法。POD样品液与愈创木酚溶液反应，每隔1 min测定OD470的值，计算POD活性。通过氮蓝四唑(NBT)光化还原法测定SOD活性，一个SOD活性单位表示为将NBT的还原抑制到对照的50 %时所需的酶量。GSH含量采用DTNB法于412 nm测定吸光度[33]。

1.8 数据统计分析

用 IBM SPSS Statistics 20 软件进行数据统计分析。所有数据均进行方差分析(ANOVA)，然后进行t检验，P<0.05时表示存在显著差异。采用SigmaPlot 12.5绘图。

2 结果与分析

2.1 Cd对旱柳生长的影响

Cd处理使新枝的生物量和茎长显著减少(P<0.05，表1)。与对照相比，Cd25和Cd75处理的新枝鲜重分别减少23.22 %和65.26 %，新枝干重分别减少24.72 %和59.76 %，最长茎长分别减少19.25 %和48.52 %(P<0.05)。不同浓度Cd处理的根系生物量和长度的变化与新枝不同(表1)。与对照相比，Cd25处理的根系鲜重和干重分别增加10.14 %和4.47 %，Cd75处理的根系鲜重和干重分别减少29.09 %和24.98 %(P<0.05)。此外，Cd25处理的最长根长与对照无显著差异(P>0.05)，Cd75处理的最长根长比对照减少33.63 %(P<0.05)。

表1 不同处理对旱柳新枝和根系的生物量和长度的影响

2.2 旱柳新枝、根系和根系细胞壁中Cd的含量

Cd处理浓度的增加使旱柳Cd积累量显著增加(P<0.05，图1-a)。与Cd25相比，Cd75处理的根系Cd积累量增加86.89 %，而新枝中的Cd含量减少25.41 %(P<0.05)。Cd25和Cd75处理的根系Cd含量分别占旱柳植株总Cd含量的68.45 %和84.46 %。与Cd25相比，Cd75处理的根系细胞壁Cd积累量增加13.42 %(P<0.05，图1-b)。

图1 旱柳新枝和根系(a)及根系细胞壁(b)的Cd含量Fig.1 Cd contents in shoots and roots (a) and root cell walls (b) of S. matsudana

2.3 植物根系细胞壁多糖对Cd的响应

Cd25和Cd75处理的根系细胞壁果胶含量相比对照分别增加64.71 %和242.10 %(P<0.05，图2-a)。根系细胞壁半纤维素含量与果胶含量的变化不同。与对照相比，Cd25处理的HC1含量无显著差异(P>0.05)，而Cd75处理的HC1升高79.97 %(P<0.05，图2-c)。HC2含量在25 μmol/L Cd处理下达到最高，较对照高33.81 %，而Cd75处理的HC2含量显著低于Cd25处理(P<0.05，图2-d)。PME活性与果胶含量变化相似，Cd处理浓度的增加使PME活性增加(图2-b)。与对照相比，Cd25和Cd75处理的PME活性分别增加33.65 %和70.51 %(P<0.05)。

果胶和半纤维素含量分别用半乳糖醛酸和葡萄糖含量表征，PME活性用反应中单位时间内H+的产量表征Pectin and hemicellulose contents were characterized by galacturonic acid and total sugar contents, respectively. PME activity was characterized by H+ yield per unit time in reactions

2.4 旱柳的氧化应激对Cd胁迫的响应

表2 不同处理对旱柳叶片和根系的氧化应激产物和MDA)含量的影响Table 2 Effects of different treatments on the contents of oxidative stress products (H2O2, and MDA) in the leaves and roots of S. matsudana

与对照相比，Cd25与Cd75处理的叶片CAT活性分别降低了45.88 %和35.81 %，根系CAT活性分别降低了37.66 %和47.31 %(P<0.05，图3-a)。Cd25处理的叶片POD活性较对照高59.28 %(P<0.05)，而在Cd75处理下与对照无显著差异(P>0.05)。Cd25和Cd75处理的根系POD活性分别较对照高203.62 %和24.04 %(P<0.05，图3-b)。Cd处理使叶片和根系的SOD活性均显著提高，与对照相比，Cd25和Cd75处理的叶片SOD活性分别提高1.54 %和1.86 %，根系SOD活性分别提高3.03 %和2.73 %(图3-c)。对于抗氧化剂GSH(图3-d)，Cd25处理的叶片GSH含量较对照高75.77 %，Cd75处理下与对照无显著差异(P>0.05)。而Cd25和Cd75处理的根系GSH含量与对照相比分别增加22.98 %和38.08 %(P<0.05)。

图3 不同处理的旱柳叶片和根系的CAT(a)、POD(b)、SOD(c)活性以及GSH含量(d)Fig.3 CAT activity (a), POD activity (b), SOD activity (c) and GSH content (d) in leaves and roots of S. matsudana under different treatments

3 讨 论

Cd被认为是毒性最强的环境污染物之一，过量的Cd会严重抑制植物生长和发育[34]。发现即使低浓度Cd也会显著抑制旱柳新枝的生长，高浓度Cd对新枝生长造成了更严重的损害，表现为新枝生物量和茎长的减少。这种生长抑制的产生，一方面可能与Cd诱导细胞壁加厚有关，细胞壁加厚会降低细胞的延展性，导致细胞伸长受阻[12]。另一方面可能与植物激素有关，Sun等[35]发现重金属会干扰植物激素的极性运输，从而导致植物激素分布紊乱并抑制植物生长。大多数情况下，由于土壤或水体污染，Cd通过根部进入植物组织，因此根系的Cd耐性对于植物生长尤为重要[36]。高浓度Cd显著抑制了旱柳根系生长，而低浓度Cd对根系生物量和根长的影响不大。该结果与前人的研究类似，Yang等[3]测试了39个柳树品种对Cd的累积特性，表明一定浓度范围的Cd不会影响甚至增加某些柳树品种的地上部或根系的生物量，当Cd浓度超出柳树的耐受范围，会导致生物量下降。

根系被认为是大多数植物积累重金属的主要部位[5]。旱柳根系Cd含量远大于新枝，根系细胞壁中积累了较大比例的Cd。大量研究表明：根系细胞壁在根系积累重金属的过程中发挥重要作用[12-13,23-24,37]。细胞壁对金属离子的结合能力高度依赖于基质多糖的含量和结构，在重金属胁迫下，植物可通过主动调节细胞壁多糖重塑，进而改变细胞壁结合金属阳离子的能力[11]。Cd胁迫下旱柳根系细胞壁的果胶含量和PME活性显著提高。果胶结合Cd的能力取决于果胶的含量和甲酯化程度[11,38]。PME能降低果胶的甲酯化程度，增加羧基的量，从而增加Cd的结合位点[7]。与Douchiche等[37]和Xu等[28]的结果类似，表明Cd不仅刺激了旱柳根系果胶含量的增加，也提高了带有更多负电基团的低甲酯化果胶的比例，从而增加了Cd结合位点。

除果胶外，细胞壁中的半纤维素作为一种支链多糖，含有大量负电基团，对细胞壁积累重金属也有很大的贡献。Yang等[27]的研究发现，细胞壁半纤维素显著促进拟南芥对铝的积累，当去除半纤维素，细胞壁对铝的积累量急剧下降。Zhu等[8]发现拟南芥根系中大多数Cd固定在HC1中，外源NAA显著增加了HC1的含量及其对Cd的结合能力。Dai等[12]和Xu等[28]均发现不同植物的细胞壁半纤维素在重金属积累过程中发挥重要作用，表现为在重金属胁迫下半纤维素含量提高。与前人的研究一致，一定浓度的Cd处理提高了HC1和HC2的含量。低浓度Cd处理的HC1含量与对照相比无显著差异，HC2的含量却显著高于对照。而高浓度Cd处理的HC1的含量显著升高，HC2的含量与对照相比无显著差异。半纤维素的结构链主要由木聚糖，木葡聚糖和甘露聚糖组成，在双子叶植物中木聚糖是主要成分[10]。推测Cd胁迫下半纤维素的合成可能存在对底物的分配，低浓度Cd处理中HC2对于结合Cd发挥主要作用，细胞倾向于合成更多的HC2。高浓度Cd处理中HC1发挥主要作用，因此，更多的底物用于合成HC1，但这需要后续的实验验证。

4 结 论

本研究结果表明：旱柳主要通过根系积累Cd，其中根系细胞壁多糖在Cd的累积过程中发挥重要作用。在Cd胁迫下，旱柳通过主动调节根系细胞壁多糖的含量和结构的改变(果胶、低甲酯化果胶和半纤维素含量的提高)，提高了细胞壁中的Cd积累。此外，旱柳具有一定的Cd耐性，但过量的Cd会破坏旱柳的氧化还原平衡，引起代谢紊乱和生长抑制，表现为叶片和根系的氧化胁迫产物增多，抗氧化酶活性和抗氧化剂含量的改变以及生物量的抑制。因此，本研究揭示了旱柳根系细胞壁多糖对旱柳富集Cd的重要性，以及高浓度Cd对旱柳生理过程的损害。