荧光定量核酸扩增检测技术在肺结核快速诊断及利福平耐药检测中的效果观察

张伟

（湖北省丹江口市疾病预防控制中心 湖北 丹江口 442700）

结核分枝杆菌感染是引起结核病的主要原因，其中以肺部感染最为多发。当前，结核分枝杆菌培养是结核病实验室诊断的金标准，其阳性率高，但检测周期过长，无法满足临床早期和快速诊治的需求，在基层医院开展困难，且可能延误治疗，因此亟需一项快速且准确的结核病诊断技术[1]。实时荧光定量核酸扩增检测是一种分子信标检测法，能作为结核分枝杆菌护利福平耐药的检测手段。本研究以我院近期收治的疑似肺结核患者为例，探讨了实时荧光定量核酸扩增检测技术在肺结核诊断与利福平耐药实验中的应用效果。

1.资料与方法

1.1 一般资料

将我院2018 年6 月—2020 年6 月期间收治的500 例可疑肺结核者/可疑耐药肺结核者作为观察对象，男性273 例，女性227 例，年龄43 ～71 岁，平均（59.34±5.78）岁。

纳入标准：①可疑肺结核者：健康体检是发现肺部阴影、伴随咳嗽、咳痰等呼吸道症状或咯血两周以上；有低热、盗汗、乏力等结核中毒症状。②可疑耐药肺结核者：既往抗结核治疗失败和复发者。

1.2 方法

1.2.1 痰标本收集 采集患者三份痰液标本，每份标本量≥2ml，分别用于痰涂片、实时荧光定量核酸扩增检测、固体罗氏培养以及液体分枝杆菌培养。

1.2.2 抗酸染色涂片 采取萋-尼式染色显微镜检查，操作流程严格遵循《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》。判定标准：连续观察300 个不同视野，均未发现抗酸杆菌判定为阴性；抗酸杆菌数1 ～8 条/300HP 判定为阳性；连续观察300 视野，3 ～9 条/100HP 为抗菌阳性（+）连续观察100 视野，1 ～9 条/10HP 为阳性（++）；1 ～9 条/HP 为阳性（+++）；≥10 条/HP 为阳性（++++）[2]。

1.2.3 分歧杆菌液体培养 将痰液标本置入50ml 离心管，加入2%N-乙酰-L 半胱氨酸-氢氧化钠前处理液，以标本实际性状为依据，处理液加入量为标本体积1 ～2 倍，进行震荡确保标本充分均匀，试管在室温环境下静置15min后，加入50ml PBS（PH值6.8），充分混匀后采用离心机进行离心，转数3000×g，时间15min。离心完成后将上清弃除，余下标本内加入1 ～3ml PBS（PH 值6.8），充分混匀，滴管吸取经处理标本0.5ml 置入MGIT960 培养管，并严格按照操作MGIT 960 说明完成剩余流程[3]。

1.2.4 分歧杆菌液体药物敏感试验 将检测阳性的菌液按照MGIT960 液体药敏试验操作进行检验，检验药物包括利福平、异烟肼、链霉素以及乙胺丁醇，药物浓度：利福平1μg/ml；异烟肼0.1μg/ml；链霉素1μg/ml、乙胺丁醇5μg/ml。

1.2.5 实施荧光定量核酸扩增技术检测 根据检测系统说明书对痰液标本进行前处理后，用移液管取2ml 经处理标本加入样本匣中，缓慢倒入避免气泡。开启分析仪完成自检，扫描样本匣条码并输入样本信息，将样本匣送入检测模块后关闭舱门，系统自动完成结果判读。检测结果等级分为：阴性、极低含量（Ct 值＞28）；低含量（Ct 值22 ～28）；中等含量（Ct 值16～22）；高含量（Ct 值＜16）。耐药检查结果以δCt 值为依据，分为：利福平敏感（δCt 值≤4）；利福平耐药（δCt 值＞4）；不确定（结果无法判读）[4]。

1.3 统计学分析

应用统计学SPSS18.0 对患者的资料进行统计分析，计数资料以（%）表示，χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 三种检测方式效能对比

临床诊断结果：321 例肺结核确诊，排除肺结核179 例。以该结果为金标准，实时荧光定量核酸扩增检测真阳性245 例，假阳性1例，真阴性178，假阴例76例。敏感度为76.32%（245/321）；特异度为99.44%（178/179）。抗酸染色涂片检测真阳性142 例，假阳34；真阴145；假阴179 例；敏感度为44.24%（142/321），特异度为81.01%（145/179）；液体培养检测真阳性274 例，假阳性0 例；真阴性179 例，假阴性47 例，敏感度为85.36%（274/321），特异度为100%（179/179）。实时荧光定量核酸扩检测敏感度与液体培养对比差异无统计学意义（P＞0.05），实施荧光定量核酸扩增检测敏感度明显高于抗酸染色图片，对比差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三种检测方式在肺结核诊断中的敏感度与特异度对比

2.2 实时荧光定量核酸扩增检测检验利福平耐药性的效能

所有纳入研究的标本中，痰结核分歧杆菌阳性共340 份，其中3 例实施荧光定量核酸扩增检测阴性，3 例检测不确定，2例无液体药敏试验结果，最终纳入332 例进行分析，将液体培养结果作为金标准，实施荧光定量核酸扩增检测的敏感度与特异度分别为82.35%（14/17）100.00%（315/315），见表2。

表2 实施荧光定量核酸扩增检测利福平耐药性效能

3.讨论

结核病及其耐药性的快速诊断是当前临床工作的一大挑战，同时也是临床研究热点。抗酸染色涂片镜检操作简便且快捷，是资源匮乏地区和基层医院开展结核病诊断的重要手段，其能直接从临床标本制备涂片，但阳性率低，敏感度也较差[5]。

本次研究提示，将临床标本作为金标准，实时荧光定量核酸扩增检测对分枝杆菌检测的敏感度与液体培养相当，明显高于染色涂片镜检，在利福平耐药实验中敏感度与特异度均高，证实了实时荧光定量核酸扩增检测技术在肺结核快速诊断中的应用价值高，值得应用。