脑Ras同源蛋白(Rheb)基因研究概况

陈旭旭 李丹妮 陈鹏宇 杨受保

(绍兴文理学院 生命科学学院, 浙江 绍兴 312000)

脑Ras同源蛋白(Ras homolog enriched in brain，Rheb)作为具有代表性的GTP结合蛋白，在脑中含量较高，与多种蛋白具有互作关系.对细胞的生长、增殖、凋亡、存活以及自噬等细胞的基本生命活动具有重要调控作用，参与多种细胞以及机体的生理及病理过程，如结节性硬化症(Tuberous sclerosis complex，TSC)以及某些肿瘤的发生.由于Rheb与雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路的特殊联系，逐渐受到了人们的关注.

1 Rheb的分子生物学特性

1.1 Rheb超家族

Rheb是Ras超家族的成员，属于Ras/Rap/Ral亚家族，该蛋白的氨基酸序列从酵母到人的不同生物中均高度保守，但不存在于植物中.Ras超家族是一类含超过150个人类蛋白质的小鸟嘌呤三磷酸酶(Guanosine triphosphatase，GTP).根据其功能和序列的相似程度，可分为五个主要亚类：Ras，Rho，Rab，Ran和Arf[1-3].Ras蛋白作为二元分子开关发挥作用，参与和调控细胞内信号网络.其调节的信号通路控制诸如细胞骨架完整性以及细胞增殖、分化、粘附、凋亡和迁移等过程.1994年Yamagata等[4]使用差异克隆技术来鉴定突触活动在大脑神经元中快速诱导的基因时，发现并克隆了Rheb基因，并提出Rheb可以活性依赖性方式在脑中被诱导.

1.2 Rheb的分子结构

Rheb是一种分子量近21kDa的单体蛋白，由184个氨基酸组成，N末端的前169个氨基酸构成GTP酶结构域，剩余的氨基酸是以CAAX基序为结尾的高度可变部分(C-半胱氨酸，A-脂肪族氨基酸，X-C-末端氨基酸)，在进化上高度保守.Rheb在如酵母的低等真核生物中仅一种基因；而在哺乳动物细胞中，已发现两种不同的Rheb基因：Rheb1和Rheb2(也称为RhebL1)，其基因产物具有52%的同一性，并具有相似的功能，但它们的组织表达谱有所不同，Rheb1普遍表达，而Rheb2表达较受限制.Rheb蛋白是由脂质锚定的细胞膜蛋白，具有5个重复的Ras相关GTP结合区域，还存在“Switch”区域I和II.当在GTP结合和GDP结合形式之间穿梭时，它们会经历构象变化[5-6].

2 Rheb的互作蛋白

2.1 TCTP

翻译控制肿瘤蛋白(Translationally controlled tumor protein，TCTP)是真核生物中广泛表达的一种保守的蛋白，结构上与磷脂酰肌醇激酶(Mammalian suppressor of Sec4，Mss4)蛋白相似，与肿瘤发生、细胞增殖与凋亡有关，在维持细胞正常生理功能中发挥重要作用[7].2001年Thaw等发现了TCTP与Mss蛋白家族在结构上具有相似性后，首次提出TCTP可能是GTP酶的鸟苷酸交换因子(Guanine-nucleotide exchange factor，GEF)[8].2007年Hsu的实验[9]证明了TCTP是调控Rheb的GEF，可以直接与Rheb相互作用.董咸池[10]通过体外和细胞实验证明了人源TCTP可与Rheb相互作用，并且可加速GDP的释放，激活mTORC1信号通路.此外，TCTP突变体E12V是一个缺乏GEF活性的突变体，解析该突变体晶体结构，发现该突变体活性的丧失并不是由于整体结构上的改变，而是因为缺少可以与Rheb上Lys45形成盐键的谷氨酸.14-3-3蛋白与TCTP和Rheb的强遗传相互作用表明它们可以共同调节器官发育，14-3-3蛋白是TCTP-Rheb相互作用和生长发育所需要的[11].上述研究明确了TCTP和Rheb的相互作用关系.

2.2 PLD1

磷脂酶D(Phospholipase，PLD)是一类能够催化磷脂酰胆碱水解的酶.其水解产物磷脂酸、二脂酰甘油及溶血磷脂酸等均可作为细胞内重要的第二信使，参与调控许多生理和生化过程，如调节细胞生长、增殖、存活和迁移等[12-13].Sun等[14]发现PLD1是HEK293细胞中血清饥饿刺激mTORC1活化所必需的.并且C2C12成肌细胞中肌源性mTOR通路的激活也需要PLD1[15-16].在没有促有丝分裂刺激的情况下，Rheb的过表达激活细胞中的PLD1，且敲除Rheb抑制血清饥饿刺激对PLD活化的作用.Rheb以GTP依赖性方式体外结合并激活PLD1，表明PLD1是Rheb的真正效应器.以上均可说明，对于mTOR信号传导的Rheb激活，PLD1是必需的.

2.3 FKBP38

FK506结合蛋白38(FK506 binding protein 38，FKBP38)，也称之为FKBP8，属于顺反异构酶FK506结合蛋白家族中的一员，是一个新发现的蛋白.FKBP38也是免疫亲和素FKBP家族的成员，可与mTOR结合并抑制其活性，即Rheb通过与FKBP38结合释放mTOR而使其具有活性[17].Bai等[18]在HEK293细胞中证实了在氨基酸和营养因子缺乏的情况下，FKBP38与mTOR的结合增强，抑制mTOR下游S6蛋白激酶1(Protein S6 kinase 1，S6K1)和4E结合蛋白-1(4 Ebinding protein 1，4E-BP1)的磷酸化.但在氨基酸和营养因子可用时，FKBP38对于mTORC1的抑制作用可被Rheb解除.Rheb是一种小G蛋白，具有小G蛋白典型的特征，即结合GTP后的Rheb可以强烈地结合FKBP38，而结合GDP的Rheb与FKBP38的结合能力很弱[19].2009年Dunlop也使用HEK293细胞证实了FKBP38可以抑制mTOR，支持Rheb-FKBP38有相互作用[20].Rheb通过其Switch区域与FKBP38的FKBP-C结构域结合，从而使结合在mTORCl上的FKBP38解离下来，激活mTORCl，并磷酸化S6K1和4E-BPl，促进蛋白质的翻译.另外，FKBP38N末端的108个氨基酸以及TM结构域对于FKBP38作用于mTORCl是必需的.利用线粒体探针实验，验证了Rheb也定位于线粒体，即二者的相互作用很有可能依赖于在线粒体上的定位[21].这些结果，均支持Rheb与FKBP38之间相互作用的关系.

3 Rheb的功能

3.1 调节细胞分化

细胞分化(Cell differentiation)是指由于细胞内基因选择性表达，导致同一来源的细胞逐渐产生出形态、结构、功能各不相同的细胞的过程.许多研究表明Rheb在一些细胞分化中起至关重要的作用.Ashraf等[22]通过研究发现Rheb在人类脂肪源性间充质干细胞(Adipose-derived stem cell，ASCs)的分化中起重要作用.ASCs是一种可分化为包括软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞等多种不同种类的细胞[23].过表达的Rheb可以增加ASCs前体的软骨生成和成骨生成，降低ASCs前体的脂肪生成.SOX9(SRY-type HMG box 9)蛋白是软骨特异性分化标志物，而Rheb可以上调SOX9、糖胺聚糖(Glyeosaminoglycans，GAGs)和II型胶原(Collagen type Ⅱ，COL2)基因表达，促进ASCs的软骨分化.Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)是成骨特异性分化标志物，Rheb可以上调该蛋白，增加钙和磷酸盐含量，促进成骨分化.此外，Rheb过表达会阻碍细胞分化成脂肪细胞.多项实验均证明Rheb在ASCs的细胞分化中起着关键作用，所以可以利用Rheb增强干细胞的软骨和成骨分化，治疗软骨和骨缺损.2019年Wang等[24]通过研究发现缺乏Rheb1也可导致细胞过度分化为骨髓.上述研究支持了Rheb与细胞分化之间存在复杂联系，但是有待于进一步研究.

3.2 mTOR信号通路与自噬

自噬(Autophagy)是指细胞通过溶酶体中的水解酶降解自身不需要或受损的细胞器和大分子，是一种细胞自身分解代谢的过程，在维持细胞内的环境稳态方面发挥重要作用.“自食”的概念最早是由De Duve[25]于1963年的研究中发现并提出的，他还在随后的研究中发现了宏观自噬和微观自噬[26].自噬的过程十分复杂，涉及多个自噬相关基因.Rheb就是与细胞自噬相关的重要基因之一[27].它有两条途径控制细胞自噬.

第一条途径是Rheb通过直接调节AMP活化蛋白激酶(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)调控细胞自噬[28].Rheb过表达，促进AMPK表达，AMPK使自噬相关蛋白Ⅲ型磷脂酰肌醇激酶(Vacuolar protein sorting 34，VPS34)和Beclin-1磷酸化，提高自噬启动因子nuc-51样激酶(Unc-51-like kinase，ULK)活性，导致细胞发生自噬[29].

第二条途径是通过控制mTOR调节其他自噬相关基因调控细胞自噬[30].mTOR是哺乳类动物的一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动、细胞存活、蛋白质合成、自噬与转录，同时又可被雷帕霉素(Rapamycin)抑制[31].其存在于两种复合物中，分别被称为mTOR复合物1(mTORC1)和mTOR复合物2(mTORC2).mTORC1是一种主要以mTOR与辅助蛋白Raptor(Regulatory associated protein of mTOR)和mLST8(Mammalian lethal with SEC13 protein 8)为核心成分的超过1MDa的二聚体复合物[32]，其机制靶标充当驱动细胞生长的代谢途径的中心调节剂，是细胞生长和代谢的主要调节因子，同时对细胞自噬有重要的调节作用.Rheb是mTOR的上游调节物，正向调控mTOR信号通路.研究表明，与GTP结合的Rheb可激活mTORC1[33]，而mTORC1对自噬有负调控作用[34].在氨基酸存在的情况下，重组激活基因(Recombinase activating genes，Rag)蛋白定位mTORC1于溶酶体上，继而被稳定定位于溶酶体的GTP结合形式的Rheb激活[35].被激活的mTOR促使ULK1和自噬相关蛋白13(Autophagy-related gene 13，ATG13)磷酸化，阻断ATG1和ATG13的相互作用，使ULK1-ATG13-FIP200(200 kDa的局灶性粘附激酶家族相互作用蛋白)多蛋白复合物的活性得到抑制，最终抑制细胞发生自噬.ULK-Atg13-FIP200复合物是mTOR信号通路调节自噬的直接靶点[36].mTORC1还通过调控转录因子EB(Transcription Factor EB，TFEB)的转录调控细胞自噬.自噬相关蛋白7(Autophagy-related gene，ATG7)是参与该类细胞自噬启动的重要基因，TFEB通过增强ATG7的表达量来调节自噬.当mTOR被Rheb激活后，mTOR在Ser211位点磷酸化TFEB.mTORC1也可能通过调控直接损害溶酶体腔酸化所需要的溶酶体蛋白的活性，如三磷酸水解酵素(Vacuolar-type ATPase，v-ATPase)，影响溶酶体功能和自噬体-溶酶体融合的过程，从而控制细胞自噬的发生[34].

上述研究证明细胞自噬受到Rheb的高度调控.因此可以通过控制Rheb的表达控制细胞自噬发生，并在今后将此运用到疾病的治疗中.

3.3 肿瘤与疾病

近年来，越来越多的研究表明Rheb与某些癌症密切相关.因此分析Rheb与肿瘤的关系对于全面认识癌症的发生发展机制以及癌症的治疗有非常重要的意义.Y35N为Rheb进化保守区域的易突变位点，该点的突变不仅影响Rheb与BRAF的相互作用，还可导致BRAF/MEK/ERK信号传导减少，最终造成细胞的癌变[37-38].此外，汪晓敏等[39]研究发现在急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)患者骨髓细胞Rheb的表达高于正常值，并且白血病细胞对阿糖胞苷药较正常的敏感，还发现低表达Rheb会造成小鼠脾脏增大.Gao Y等[40]通过建立Rheb1缺失的MLL-AF9小鼠AML模型发现若缺失Rheb1，AML小鼠的生存时间将增加.上述研究为证明Rheb与白血病存在密切关系提供了有力的证据，也为白血病的治疗提供了一种新思路.

4 小结与展望

Rheb是在进化上高度保守的GTP结合蛋白，可通过mTOR信号通路影响下游基因，调控细胞自噬的发生，影响细胞的分化，在抑制肿瘤和癌症方面有重要作用.迄今为止，对于Rheb的研究主要建立在mTOR信号通路的基础上，二者功能的交集还处于未知状态.除此之外，虽然Rheb在抑制肿瘤和癌症中有不可忽视的作用，但将其投入药用依然具有挑战性.通过对作用机理的深入探索，进一步了解其生物学特性与功能，在医学上的具体应用产生突破.