松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的原核表达与活性测定

李煜　吴小芹　胡龙娇

摘要：【目的】純化获得松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1并验证其体外活性，为后续研究效应蛋白Bx-FAR-1参与松材线虫侵染松树的分子机制打下基础。【方法】利用PCR技术从松材线虫cDNA中扩增出效应基因Bx-FAR-1，用同源重组的方式将目的片段连接至原核表达载体pET-32a（+）。通过原核表达系统诱导并纯化获得大量效应蛋白Bx-FAR-1，利用SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western blotting对纯化获得的蛋白进行鉴定，同时通过本氏烟瞬时表达系统验证蛋白活性。【结果】从松材线虫cDNA中成功扩增出Bx-FAR-1基因（BXY_1685000.1）;通过同源重组成功获得重组表达载体pET32a-BxFAR，并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞。当诱导条件为15 ℃下150 r/min诱导16 h时重组蛋白以可溶性形式表达，且蛋白表达量高。效应蛋白Bx-FAR-1活性测定结果显示，当蛋白浓度达100 nmol/L时，可抑制致病疫霉的病原相关分子模式（PAMP）INF1引起的烟草细胞坏死。【结论】松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1可抑制寄主植物的免疫反应。

关键词： 松材线虫;效应蛋白;原核表达;蛋白纯化

中图分类号： S763                                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）11-2731-07

Prokaryotic expression and activity research of Bursaphelenchus xylophilus effector protein Bx-FAR-1

LI Yu1，2， WU Xiao-qin1，2*， HU Long-jiao1，2

（1Co-innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China/College of Forestry， Nanjing Forestry University， Nanjing  210037; 2Jiangsu Key Laboratory for Prevention and Management of Invasive Species， Nanjing  210037）

Abstract：【Objective】This paper aimed to obtain Bursaphelenchus xylophilus effector protein Bx-FAR-1 and verify its activity in vitro， and provide a basis for further study on the role of effector protein Bx-FAR-1 in the pathogenesis of B. xylophilus. 【Method】The target gene Bx-FAR-1 was amplified from B. xylophilus cDNA by PCR. The target gene was inserted into the expression vector pET-32a（+） by homologous recombination， and a large quantity of effector protein Bx-FAR-1 was obtained by prokaryotic expression system. The purified protein was identified by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE） and Western blotting， and its activity was verified by transient expression system in Nicotiana benthamiana. 【Result】The Bx-FAR-1 gene（BXY_1685000.1） was successfully amplified by PCR from B. xylophilus cDNA and inserted into the expression vector pET-32a by homologous recombination. The recombinant plasmid pET32a-BxFAR was transformed into Eschrichia coli BL21 for subsequent induced expression and purification. The recombinant protein was expressed in soluble form and the high level under the induction conditions 15 ℃ and 150 r/min for 16 h，and the expression of protein was high. The purified Bx-FAR-1 protein at a concentration of 100 nm/L could significantly inhibit Phytophthora infestans pathogen-associated molecular pattern（PAMP） INF1-induced programmed cell death in N. benthamiana. 【Conclusion】B. xylophilus effector protein Bx-FAR-1 could inhibit the immunological reaction of host plant.

Key words： Bursaphelenchus xylophilus; effector protein; prokaryotic expression; protein purification

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFD0600203）;Priority Academic Development Program of Jiangsu Higher Education Institutions（PAPD）

0 引言

【研究意义】松材线虫（Bursaphelenchus xylophi-lus）引起的松材线虫病对我国松林造成严重破坏并带来巨大经济损失（叶建仁和黄麟，2012;郝焰平等，2019）。目前已有大量关于松材线虫致病机制的研究，如酶学说、空洞化学说、毒素学说和致病相关基因等（Futai，2013;理永霞和张星耀，2018），但这些研究结果仍未能完善地解释松材线虫引起松树发病的机制。在病原与寄主植物互作过程研究中发现，病原侵染早期分泌的效应蛋白是侵染寄主的关键因子（Jones and Dangl，2006）。因此，纯化获得松材线虫的效应蛋白，不仅有利于深入研究松材线虫与松树互作机制，更能进一步揭示松材线虫的致病机理。【前人研究进展】病原侵染寄主植物时，植物先天免疫系统会识别病原相关分子模式（Pathogen associa-ted molecular pattern，PAMP），随后植物会发生细胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD），从而阻止病原进一步侵染（Jones and Dangl，2006）。为应对植物免疫，病原会分泌效应子抑制寄主植物识别，或靶向参与寄主植物免疫，从而抑制植物免疫反应促进病原毒力，提高寄主的易感病性，这种现象在病原物的整个侵染过程中占据着重要地位（Macho and Zipfel，2014，2015;Su et al.，2018）。已有研究表明，多种植物寄生线虫的效应子均起到调控寄主免疫促进线虫侵染的作用。Chen等（2018）研究證实，水稻根结线虫的效应子MgMO237会被分泌到水稻各组织的细胞中与防御相关蛋白反应，这些蛋白与β-1，3-葡聚糖合成、茉莉酸（JA）响应等途径相关，推测MgMO237很可能通过干扰这些途径从而调控寄主的基础免疫;Luo等（2018）利用本氏烟（Nicotiana benthamiana）瞬时表达试验发现禾谷孢囊线虫效应子HaVAP1和HaVAP2均可抑制小鼠凋亡蛋白BAX引起的烟草PCD，利用RNAi技术发现沉默效应子HaVAP1会促进线虫寄生，而沉默效应子HaVAP2则会抑制线虫寄生，并通过酵母双杂试验证明效应子HaVAP2与大麦中的类CYPRO4蛋白HvCLP互作;Wang等（2018）研究发现，利用农杆菌渗透法在本氏烟叶片上表达南方根结线虫效应子Mi-CM-3时，本氏烟中水杨酸合成以及水杨酸调控的免疫反应被抑制，推测效应子Mi-CM-3会干扰寄主植物的水杨酸途径，抑制植物免疫反应从而促进线虫寄生。有关松材线虫效应子的研究，Espada等（2016）通过分析松材线虫转录组数据，预测出一批松材线虫候选效应子，包括细胞色素P450基因、溶菌酶蛋白基因、VAP蛋白基因和谷胱甘肽转移酶基因等;Hu等（2019）通过分析转录组数据并利用本氏烟瞬时表达系统，筛选到效应子BxSapB1，该效应子作用于烟草细胞质外体时可触发烟草PCD，进一步利用RNAi技术抑制BxSapB1的表达后，松材线虫致病力明显下降，并且BxSapB1在松材线虫强毒虫株中表达量较高，推测其对线虫毒力起到重要作用;Huang等（2019）、Zhao等（2020）利用烟草试验筛选到触发烟草PCD的效应子BxSapB2和BxSapB3，这2个效应子的表达被抑制后均能导致松材线虫致病力下降。但关于松材线虫效应基因的功能研究仍十分有限，主要原因是采用的RNAi技术具有局限性，且松材线虫侵染过程中可能存在多个效应基因共同作用。仅通过干扰后接种试验，难以准确地反映某一基因的具体功能。【本研究切入点】目前，关于松材线虫效应子功能的研究多在基因水平上进行，而其效应蛋白功能验证的研究较少，且抑制寄主免疫反应的效应蛋白研究尚未见文献报道。【拟解决的关键问题】通过构建原核表达载体并在大肠杆菌中进行诱导表达，纯化获得本研究团队前期筛选获得的在松材线虫侵染早期高表达的效应蛋白Bx-FAR-1，并验证其是否具有抑制烟草PCD的活性，为后续研究效应蛋白Bx-FAR-1参与松材线虫侵染松树的分子机制打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试松材线虫、本氏烟、含INF1的农杆菌甘油菌、原核表达载体pET-32a（+）、大肠杆菌（Eschrichia coli）BL21和JM109菌株均由南京林业大学森林病理实验室保存。

高保真酶、反转录试剂盒和ClonExpress?II快速克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;限制性内切酶、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司;Ni-NTA纯化树脂预装柱购自生工生物工程（上海）股份有限公司;山羊抗鼠IgG/HRP、His标签单抗和ELC化学发光试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;BCA蛋白定量分析试剂盒购自赛默飞世尔科技公司;其他生化试剂均为国产分析纯。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 目的基因克隆 根据松材线虫Bx-FAR-1基因（BXY_1685000.1）序列，利用Premier Primer 5.0设计扩增引物;根据后续试验中载体连接采用同源重组方式，设计的上、下游引物5'端分别加上一段15～20 bp同源臂序列，特异性引物为F：5'-TATCGG ATCCGAATTCATGAAGTTTCATCAGGTCCG-3'和R：5'-GACGGAGCTCGAATTCCAGTTTGCCTTTA GCTAACTC-3'。贝尔曼漏斗法收集约5000条松材线虫，用无菌水对线虫表面进行清洗，使用TRIzol法对松材线虫进行RNA提取，然后取2 μL RNA通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，再使用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis反转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，进行高保真PCR扩增，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳验证并用Agarose Gel DNA Purification试剂盒切胶回收。

1. 2. 2 原核表达载体的构建与鉴定 对原核表达载体pET-32a进行EcoR I单酶切，根据ClonExpress?II 快速克隆试剂盒说明书，将目的基因片段连接到酶切过的载体上。连接产物转化至JM109感受态细胞，挑取单菌落用T7引物进行菌落PCR扩增，PCR结果为阳性的菌落接种到含50 ?g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃过夜摇培，提取质粒送金斯瑞生物科技股份有限公司测序。

1. 2. 3 重组蛋白诱导条件优化 将测序正确的质粒转化到大肠杆菌BL21表达感受态细胞中，然后接种至氨苄抗性的LB液体培养基，37 ℃过夜培养，挑取单菌落用T7引物进行菌落PCR扩增。将阳性克隆接种至含50 ?g/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，37 ℃ 180 r/min过夜培养;按体积比1∶100的比例转接于LB液体培养基中，37 ℃培养，当菌液OD600达0.6左右时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，在以下3种诱导条件下诱导：37 ℃下200 r/min诱导6 h、25 ℃下180 r/min诱导12 h和15 ℃下150 r/min诱导16 h。诱导结束4 ℃ 10000 r/min离心5 min收集上清液，取40 μL上清液并加入10 μL蛋白上样缓冲液吸打混匀，沸水浴5 min，使其完全变性。然后进行SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，比较不同诱导条件下重组蛋白表达情况，选出最佳诱导条件。

1. 2. 4 重组蛋白的可溶性分析与纯化 取上清中重组蛋白表达量较高的诱导条件，扩大培养体系进行重组蛋白的大量诱导表达。4 ℃ 10000 r/min离心10 min收集菌体沉淀于50 mL干净的离心管中，用适量PBS缓冲液充分悬浮菌体，4 ℃ 10000 r/min离心10 min并去上清，重复3次，再加入3～5 mL PBS缓冲液重悬浮。冰上超声破碎菌体（300 W，超声2 s，停3 s，共20 min），將破碎后的液体离心，分别收集上清和沉淀，并对其进行SDS-PAGE。按照Ni-NTA纯化树脂预装柱说明书，纯化表达蛋白，用50 mmol/L咪唑洗脱液对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱液，并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。

1. 2. 5 Western blotting鉴定 SDS-PAGE结束后，将蛋白转到PVDF膜上;加入含4%脱脂奶粉的PBST，室温封闭1.0 h;加入一抗His标签单抗，室温孵育1.5 h;PBST漂洗3次后加入二抗山羊抗鼠IgG/HRP，室温孵育30 min;PBST漂洗3次，加入显色液显色，拍照记录。

1. 2. 6 烟草瞬时表达试验 按照BCA蛋白定量分析试剂盒说明书对纯化蛋白的浓度进行检测，根据蛋白浓度检测结果，用PBS缓冲液将Bx-FAR-1蛋白溶液稀释成不同浓度（100 pmol/L、300 pmol/L、3 nmol/L、30 nmol/L、100 nmol/L、300 nmol/L、1 μmol/L、3 μmol/L），用1 mL去掉针头的注射器分别将不同浓度的Bx-FAR-1蛋白溶液渗透到本氏烟叶片中。先用针头在烟草下表皮刺一小伤口，将100 μL的Bx-FAR-1蛋白溶液注射到伤口周围叶片细胞间，然后在相同的位置再注射含INF1的农杆菌菌悬液。以注射3 ?mol/L BSA牛血清白蛋白为阴性对照，只注射含INF1农杆菌菌悬液为阳性对照。注射5～7 d后，观察烟草叶片细胞坏死情况，并拍照记录。

1. 2. 7 蛋白序列分析 使用SignalP 4.0 Server （https：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽;使用TMHMM 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测跨膜结构;通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在线对保守结构域进行蛋白保守结构域预测分析;使用SOPMA和Phyre 2在线软件预测蛋白二级结构。

2 结果与分析

2. 1 松材线虫Bx-FAR-1蛋白序列分析结果

根据松材线虫转录组数据，Bx-FAR-1基因的cDNA序列长度为498 bp，编码165个氨基酸。利用SignalP 4.0 Server和TMHMM 2.0 Server在线软件预测其信号肽长度为57 bp，且无跨膜结构，说明松材线虫可分泌该蛋白至体外。NCBI比对结果显示Bx-FAR-1基因具有脂肪酸与视黄醇结合蛋白（FAR）结构域，Bx-FAR-1蛋白二级结构预测结果表明该蛋白结构以α-螺旋为主，占比达83%（图1），与其他线虫的FAR蛋白结构相类似。

2. 2 松材线虫Bx-FAR-1基因扩增结果

以松材线虫的cDNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增，扩增产物经1%凝胶电泳检测，结果（图2）显示扩增产物条带单一，大小略小于500 bp，与预期结果（470 bp）一致，说明PCR产物可切胶回收用于后续试验。

2. 3 松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1原核表达载体构建与鉴定

通过同源重组的方式，将Bx-FAR-1基因的纯化产物连接至经过酶切的原核表达载体pET-32a（+）上，构建重组表达载体pET32a-BxFAR，载体通过菌落PCR和基因测序进行双重验证。菌落PCR产物经凝胶电泳显示目的条带大小1000 bp左右（图3），与预期大小一致。测序结果显示，重组载体含有Bx-FAR-1基因且基因序列与参考序列完全一致，证明效应蛋白Bx-FAR-1原核表达载体构建成功。

2. 4 松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的诱导表达

将构建的重组表达载体pET32a-BxFAR转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，在3种不同的诱导条件（37 ℃ 200 r/min诱导6 h、25 ℃ 180 r/min诱导12 h和15 ℃ 150 r/min诱导16 h）下进行诱导表达，诱导结束后收取菌液进行SDS-PAGE。结果（图4）表明，与空载体对照相比，当诱导条件为15 ℃ 150 r/min诱导16 h时蛋白条带最明显，说明该诱导条件下目的蛋白表达量最高。

2. 5 松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1的可溶性分析及纯化

在最佳诱导条件15 ℃ 150 r/min下诱导16 h，大量诱导表达重组蛋白，使用超声波细胞粉碎机破碎菌体，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE检测重组蛋白可溶性。结果（图5）显示，与重组载体pET32a-BxFAR沉淀相比，在约33 kD处有明显的特异蛋白条带出现在重组载体pET32a-BxFAR上清，说明重组蛋白主要以可溶性形式表达。

利用Ni-NTA树脂进行重组蛋白纯化，收集洗脱液并进行SDS-PAGE和Western blotting检测，SDS-PAGE结果（图6）显示，纯化蛋白仅在33 kD处有一特异条带，anti-His抗体同样仅在33 kD处检测到目的蛋白，说明成功获得并纯化出效应蛋白Bx-FAR-1。

2. 6 松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1活性测定

对纯化获得的效应蛋白Bx-FAR-1进行梯度稀释，并通过本氏烟瞬时表达试验测定不同浓度的效应蛋白Bx-FAR-1是否能抑制激发子INF1引起的烟草PCD。结果（图7）显示，注射的效应蛋白浓度达100 nmol/L及以上时烟草细胞未发生坏死，注射区域仍呈绿色;效应蛋白浓度低于100 nmol/L时注射区域的烟草细胞发生坏死，表现为灰绿色;而注射BSA的阴性对照和仅注射激发子INF1的阳性对照烟草细胞均发生坏死，注射区域呈灰绿色。说明松材线虫的效应蛋白Bx-FAR-1对INF1引起的烟草PCD具有抑制作用。

3 讨论

目前在所有类型的植物病原中均发现有保守效应子存在，这些效应子可通过调控植物激素信号、影响植物代谢及干扰植物免疫，从而达到促进病原侵染的目的，在病原的致病过程中起到重要作用（Kamoun，2006;Toru?o et al.，2016），松材线虫效应子的功能探究已成为研究其致病机制的突破点。本研究团队在前期研究中筛选并获得多个松材线虫效应子，其中本研究的效应子Bx-FAR-1编码脂肪酸与视黄醇结合蛋白（FAR），该蛋白为一类线虫特异的脂质结合蛋白，已在多种植物寄生线虫中被鉴定。对马铃薯白线虫（Globodera pallida）Gp-FAR-1基因的研究结果表明，其编码的FAR蛋白可结合包括亚麻油酸和亚油酸的脂肪酸，是JA信号转导的前体，且在体外试验中FAR蛋白可抑制脂氧合酶（LOX）的活性（Prior et al.，2001）。Iberkleid等（2013）在对瓜哇根结线虫（Meloidogyne javanica）Mj-FAR-1基因的研究中发现，Mj-FAR-1基因同样可调控植物的JA信号通路，且可能通过影响JA途径提高植物易感性。FAR蛋白已被证实与植物寄生线虫生长发育过程中的脂质获取、营养物质的分布及繁殖有关，可结合广泛的脂肪酸和视黄醇，包括参与JA信号途径的亚油酸和亚麻酸，与抑制植物JA响应基因的表达，干扰寄主的免疫反应有直接关系（Prior et al.，2001;Iberkleid et al.，2013;Zhang et al.，2015;Vieira et al.，2017）。

目前松材线虫致病相关基因，如BxSapB1、BxSapB3和cpy-33C9等，多采用RNAi技术抑制线虫体内基因的表达，再进行活体接种试验，从而探究致病基因对线虫致病力的影响（Hu et al.，2019;Huang et al.，2019;Qiu et al.，2019）。但由于影响松材线虫毒力的因素具有多样性，干扰后接种试验仅反映出致病基因对松材线虫的致病力是否存在影响，而不能验证该致病基因的具體功能。Li等（2016）采用直接接种松材线虫类毒液过敏原（VAP）蛋白的方式，证明VAP蛋白可诱导寄主发生免疫反应，引起松树体内α-蒎烯含量升高，且对松树有毒害作用。将松材线虫致病基因编码的纯蛋白接种至松树体内，更能准确地反映蛋白对寄主产生的影响。因此，要进一步了解效应子Bx-FAR-1在松材线虫致病过程中的作用，同样需要获得具有活性的效应蛋白Bx-FAR-1，在蛋白水平上对其功能进行更深入的研究。

本研究采用同源重组的方式构建原核表达载体pET32a-BxFAR，该方法不受酶切位点的限制，且操作便捷，重组效率高。为获得具有可溶性且表达量高的重组蛋白，本研究参考其他效应蛋白原核表达试验（宋天巧，2015;李琦，2016），对诱导温度、转速和诱导时间进行调整，设置了3种不同的蛋白诱导表达条件，发现在15 ℃ 150 r/min诱导16 h条件下重组蛋白的表达最明显且具有可溶性，为后续大量诱导蛋白提供了条件。为检测所得蛋白的活性并验证松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1是否可抑制由INF1引起的烟草细胞坏死，本研究利用本氏烟瞬时表达系统，同时注射效应蛋白和含INF1的农杆菌，发现效应蛋白浓度达100 nmol/L时具有抑制烟草PCD的活性，表明效应蛋白发挥作用需要达到一定的浓度，这一结果也为后续进行蛋白功能验证时蛋白浓度的选择提供了数据支持。本研究通过原核表达成功获得具有活性的松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1，可在此基础上参考其他植物寄生线虫致病相关基因的研究（Chen et al.，2017，2018），通过荧光免疫定位、免疫共沉淀等研究方法，进一步探究效应蛋白Bx-FAR-1在植物体内发挥作用的位点、影响的植物通路以及干扰植物免疫的机理等，从而了解效应蛋白Bx-FAR-1在松材线虫致病过程中的作用。

4 結论

原核表达系统可成功诱导表达并纯化得到松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1，且蛋白体外具有活性，当浓度达100 nmol/L时可抑制由INF1引起的烟草细胞坏死。表明松材线虫效应蛋白Bx-FAR-1可抑制寄主植物免疫反应，后续可在蛋白水平上进一步研究其在松材线虫致病中的作用。

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（责任编辑 麻小燕）

收稿日期：2020-05-12

基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFD0600203）;江苏高校优势学科建设工程项目（PAPD）

作者简介：*为通讯作者，吳小芹（1957-），教授，主要从事森林微生物与森林病理研究工作，E-mail：xqwu@njfu.edu.cn。李煜（1995-），研究方向为森林病理，E-mail：aqliyu1234@163.com