东方山羊豆种质资源ISSR分析

罗天琼　王小利　张瑜　莫本田　张明均

摘要：【目的】分析東方山羊豆种质资源遗传多样性，为其种质资源鉴定评价、新品种选育及开发利用提供理论参考。【方法】以4份引进东方山羊豆种质及其29份杂交后代为材料，利用ISSR引物对其进行多态性扩增，并以PopGene 32计算其遗传参数，采用NTsys-pc 2.1计算遗传相似系数，运用SHAN模型中的非加权配对算术平均法（UPGMA）绘制聚类树状图。【结果】从24条ISSR引物中筛选出8条扩增条带清晰、多态性良好且易扩增的引物，利用其从33份东方山羊豆种质材料中共扩增出79条条带，其中65条具有多态性，多态百分率为82.15%;观察等位基因数（Na）为1.6667～2.0000，平均为1.8215，有效等位基因数（Ne）为1.2212～1.5740，平均为1.4242;Nei基因多样性指数（H）为0.1521～0.3322，平均为0.2509，Shannon多态信息指数（I）为0.2473～0.4976，平均为0.3813。这些种质材料遗传相似系数为0.5696～0.9241，平均为0.7623，在0.7140处可划分为三大类群（Ⅰ～Ⅲ），分别包含25、3和5份种质材料，不同地理来源种质相互混杂分布。【结论】东方山羊豆遗传多样性较丰富，其中第Ⅱ类群和第Ⅲ类群遗传多样性较第Ⅰ类群更丰富，具有优良亲本基因源选择的潜力，可作为东方山羊豆不同亲本选配和杂种优势加以利用。

关键词： 东方山羊豆;种质资源;ISSR;聚类分析;遗传多样性

中图分类号： S541.9                               文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）11-2636-08

ISSR analysis of Galega orientalis germplasms resources

LUO Tian-qiong1， WANG Xiao-li1*， ZHANG Yu1， MO Ben-tian2， ZHANG Ming-jun3

（1Institute of Pratacultural， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang  550006， China; 2Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science， Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guiyang  550005， China;

3Guizhou Grassland Technology Test and Extension Station， Guiyang  550006， China）

Abstract：【Objective】The genetic diversity of Galega orientalis germplasm resources was analyzed  to provide theoretical reference for the identification and evaluation of G. orientalis germplasm resources，breeding of new varieties，development and utilization. 【Method】Four imported G. orientalis germplasms and 29 hybrid progenies were used as ma-terial for polymorphic amplification using ISSR primers. Based on the amplification results，The genetic parameters were calculated by PopGene 32. The genetic similarity coefficient analysis was performed by NTSYS 2.1，and the unweighted paired arithmetic mean（UPGMA） in SHAN model was used to construct the cluster tree. 【Result】Eight primers with clear polymorphic bands，good polymorphism and esay amplification were selected from 24 ISSR primers. A total of 79 bands were amplified from 33 G. orientalis germplasm resources by ISSR primers，among which 65 bands were polymorphic，the polymorphism  rate  was 82.15%. The observe number of alleles（Na） were ranged from 1.6667 to 2.0000，with average of 1.8215， the effective number of alleles（Ne） were 1.2212 to 1.5740，with an average of 1.4242. The Neis genetic diversity index（H） was ranged from 0.1521 to 0.3322，with an average of 0.2509.  Shannon polymorphic information index （I） was ranged from 0.2473 to 0.4976，with an average of 0.3813. The genetic similarity coefficient of germplasm materials were 0.5696-0.9241，and the average was 0.7623. At genetic similarity coefficient of 0.714， the germplasm materials could be divided into three groups（Ⅰ-Ⅲ） with 25， 3 and 5 germplasm resources respectively， the different geographical source germplasm was mixed distribution. 【Conclusion】G. orientalis has rich genetic diversity，  the class Ⅱand class Ⅲ germplasms of genetic diversity were more abundant than classⅠ，they have the potential of excellent parental gene source selection and can be used in different parental selection and heterosis utilization of G. orientalis.

2 结果与分析

2. 1 东方山羊豆种质材料的ISSR多态性分析结果

33份东方山羊豆种质材料基因组DNA的检测结果见图1。用24条ISSR引物进行PCR扩增，结果发现807、834、835、836、868、856、ISSR22和ISSR26共8条ISSR引物的扩增条带清晰，条带数较多，多态性良好，且易于扩增，可用于33份东方山羊豆种质材料的多态性扩增，其中引物834的扩增效果最好（图2）。

利用筛选出的8条引物对33份东方山羊豆种质材料共扩增出79条清晰条带，其中多态性条带65条，多态百分率为82.15%，平均每条引物扩增的条带数为9.875条，平均每条引物扩增的多态性条带为8.125条（表3）。利用PopGene 32计算33份东方山羊豆种质材料的遗传参数，结果显示，33份东方山羊豆种质材料的Na为1.6667～2.0000，平均为1.8215，Ne为1.2212～1.5740，平均为1.4242;H为0.1521～0.3322，平均为0.2509，I为0.2473～0.4976，平均为0.3813（表3）。

2. 2 东方山羊豆种质亲缘关系分析结果

基于ISSR多态性分析结果，利用NTsys-pc 2.1计算获得遗传相似系数（表4）。遗传相似系数越大，遗传差异越小，表明亲缘关系越近，遗传多样性越低;反之亦然。33份东方山羊豆种质材料的遗传相似系数为0.5696～0.9241，平均为0.7623，其中，遗传相似系数主要分布在0.6600～0.8590，说明33份东方山羊豆种质材料间亲缘关系远近程度不同，遗传多样性丰富。GY04号白花（编号4）与GY05号白花（编号5）遗传相似系数为0.9241，表明二者间遗传距离最近;GY14号白花（编号13）与GYS18（编号33）的遗传相似系数为0.5696，表明二者间遗传距离最远，变异最大。

2. 3 东方山羊豆种质的聚类分析结果

通过UPGMA法对33份供试材料的ISSR多态性进行聚类分析，结果如图4所示。33份东方山羊豆种质资源在遗传相似系数0.7140处可分为三大类群（Ⅰ～Ⅲ）。第Ⅰ类群包括25份种质，其在遗传相似系数0.7260处又可分为2个亚群Ⅰ-1和Ⅰ-2：Ⅰ-1亚类包括23份种质，其中GY07号白花（编号7）、ZNK18（编号26）、GYN18（编号29）和GYP18（编号30）与其他19份种质的遗传相似系数介于0.7380～0.7500，说明其亲缘关系较远，遗传多样性较丰富;进一步分析发现，在这19份种质中，GY04号白花（编号4）与GY05号白花（编号5）种质间的亲缘关系最近，遗传差异最小，其余17份种质中位于同一小分支种质的亲缘关系较近，遗传多样性较低，如ZNH18（编号23）与GYI18（编号24）二者间、ZNE18（编号22）、ZN小叶（编号20）和GY大叶（编号19）三者间等。Ⅰ-2亚群包括GY08号白花（编号8）和GY17号白花（编号15）2份种质，二者的遗传相似系数为0.7342，说明其亲缘关系较远，存在一定的遗传差异。第Ⅱ类群包括GY10号白花（编号10）、GY16号白花（编号14）和GYD18白花（编号16）3份种质。第Ⅲ類群包括GYJ18（编号25）、GYM18（编号28）、GYQ18（编号31）、GYS18（编号33）和GYR18（编号32）等5份种质，其中GYR18与另外4份遗传相似系数介于0.7140～0.7260，说明其亲缘关系较远，遗传差异较大，遗传多样性较丰富。综上所述，不同地理来源种质相互混杂分布，种质资源间遗传分布与地理来源间无明显相关性，第Ⅱ类群和第Ⅲ类群东方山羊豆种质材料间遗传多样性较第Ⅰ类群丰富。

3 讨论

遗传多样性是物种长期进化的结果，也是物种生存适应和发展进化的前提，其最直接的表现形式是遗传变异。东方山羊豆是一种优良豆科牧草，具有产草量高、利用年限长、促进奶牛产奶、家畜采食不得膨胀病等特点，可部分替代紫花苜蓿，具有较高的经济和生态价值（沈禹颖等，2003）。当前，东方山羊豆商业用种极少，主要栽培品种是前苏联和东欧国家培育的Gale，但其难以适应我国不同生态区环境，无法大面积推广种植。因此，选育适宜我国不同生态地区种植的新品种是推广利用东方山羊豆的重要保证，而对东方山羊豆种质资源遗传多样性评价是优良新品种亲本选择的重要环节，也是挖掘创制新材料、培育新品种的重要物质基础。

本研究采用8条ISSR引物对33份东方山羊豆种质材料进行遗传多样性分析，共扩增79条带，其中多态性条带65条，多态百分率为82.15%，遗传相似系数为0.5696～0.9241。可见，虽然33份东方山羊豆种质中有29份均为其余4份材料的杂交后代，但其遗传多样性仍较丰富;通过聚类分析发现，这些种质在遗传相似系数0.7140处可分为三大类群，不同地理来源种质相互混杂分布，表明种质资源间遗传分布与地理来源间无明显相关性。余国辉等（2014）用9对ISSR引物对33份东方山羊豆种质进行遗传多样性分析，共扩增出110条带，其中多态性条带107条，多态性比率为96.7%，遗传相似系数为0.216～0.812，表明其遗传多样性较本研究供试材料更丰富;通过聚类分析发现，这些东方山羊豆种质在遗传相似系数0.42处分为三大类，不同地理来源种质相互混杂分布。虽然本研究与Osterman等（2011）、余国辉等（2014）的供试东方山羊豆种质资源来源于不同地理区域，但研究结果均表明东方山羊豆种质资源的遗传多样性和遗传分布与地理位置分布无明显相关性。可见，东方山羊豆种质资源遗传背景广泛，具有优良亲本基因源选择的潜力，其原因可能是东方山羊豆为异花授粉植物，受自然环境选择、基因突变、相互杂交等因素影响较大，导致其丰富的遗传多样性（Osterman et al.，2011;尹淑英等，2016）。

此外，本研究分析三大类群的形态特征，结果发现同一类群材料的叶形、叶长、叶宽、分枝数、花色、株高等形态学性状的多样性指数较丰富，如GYR18植株最高，GYI18分枝数最多，与王俊娥等（2008）的结论一致。因此，今后可进一步利用ISSR分子标记按照不同育种目标需求选择亲本选配材料和杂种优势利用材料，为东方山羊豆种质资源鉴定评价、新品种选育提供参考依据。

4 结论

东方山羊豆遗传多样性较丰富，其中第Ⅱ类群和第Ⅲ类群遗传多样性较第Ⅰ类群更丰富，具有优良亲本基因源选择的潜力，可作为东方山羊豆不同亲本选配和杂种优势加以利用。

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（責任编辑 陈 燕）

收稿日期：2020-02-14

基金项目：中国南方草地牧草调查项目（2017FY100602）;国家现代牧草产业技术体系建设专项（CARS-34）;贵州省科技计划项目（黔科合支撑〔2016〕2624-2号）

作者简介：*为通讯作者，王小利（1977-），博士，研究员，主要从事分子育种研究工作，E-mail：wangxiaolizhenyuan@126.com。罗天琼（1969-），研究员，主要从事牧草种质资源与育种研究工作，E-mail：ltq19691102@163.com