壬基酚对赤子爱胜蚯蚓（Eisenia foetida）的生态胁迫及茶多酚的缓解作用

陈建华　张碧尧　李丹佩　陈世红　谢艳颖　王国红

摘要：【目的】研究壬基酚（NP）对赤子爱胜蚯蚓（Eisenia foetida）的生态胁迫效应，并探讨茶多酚对NP引发蚯蚓生态胁迫的缓解作用。【方法】采用自然土壤法研究壬基酚（NP）对赤子爱胜蚯蚓的生态胁迫效应，通过在NP基础液中添加不同质量分数的茶多酚，探讨茶多酚对NP胁迫下蚯蚓生活状态的影响、致死毒性、回避行为及生长抑制的缓解作用，同时采用HE组织切片染色法初步探讨NP毒性的作用机理。【结果】400mg·kg-1NP对蚯蚓具有强烈的致死毒性，100～200mg·kg-1NP对蚯蚓具有一定的致死毒性，其致死毒性与染毒时间、染毒量呈正相关;NP为200mg·kg-1时对蚯蚓生长抑制率达34%，具有显著差异;通过组织切片试验证实，NP胁迫下，蚯蚓空泡化腺细胞减少，环肌层变薄，角质层脱落，表皮层增厚;蚯蚓对12.5～200mg·kg-1的NP具有回避反应。在壬基酚基础液中添加70～700μg·kg-1的茶多酚后，蚯蚓致死率和生长抑制率均有显著下降。0.7～7.0μg·kg-1的茶多酚能明显缓解蚯蚓的回避反应。与NP对照组相比，添加0.7—700.O¨g.kg-l茶多酚后蚯蚓体壁环肌层厚度增加，角质层恢复光滑完整。【结论】100～400mg·kg-1的NP对赤子爱胜蚯蚓具有生态毒性作用，0.7～700.0μg·kg-1的茶多酚对NP胁迫蚯蚓生态毒性具有缓解作用。

关键词：壬基酚;蚯蚓;茶多酚;生态毒性;缓解作用

中图分类号：Q89

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（2020）11-1271-09

0引言

【研究意义】壬基酚（ Nonylpheol，NP）是壬基酚聚氧乙烯醚（Nonylphenol polyethylene glycol ether，NPEO）的生物降解产物，在工业、农业以及日常生活中大量存在[1]。随着NPEO类农药的喷洒、污水灌溉以及淤泥填肥，土壤中的NP污染日益严重[2]。现已知NP在土壤中具有强吸附性、难淋溶和移动性差的特点，而且在土壤中的半衰期可高达60年[3]。土壤中NP对土壤生物的影响具有持久性，研究NP污染治理具有现实意义。【前人研究进展】作为一种环境雌激素，NP的分子结构与雌二醇相似，进入牲畜或人体后，可与机体中的雌二醇竞争结合受体，干扰内分泌功能[4]。目前已知土壤中长期存在的NP不仅可以向农作物迁移，而且能在蚯蚓等土壤动物体内蓄积，不仅影响土壤生物的生存、生长和产量，同时易通过农作物的富集，最终进入牲畜与人体体内，发挥其毒性作用[5-7]。茶多酚是茶叶中提取的天然物质，有强抗氧化、抗畸变、抗癌等作用。近年来，有关茶多酚与生物体内雌激素的相关作用引起了许多学者的广泛兴趣。有学者认为茶多酚能减少雌激素的代谢或减少雌激素与受体的结合[8-9]，这为阻断环境雌激素与受体结合，进而解除或缓解由环境雌激素导致的毒性作用提供了新的思路。资料表明茶多酚对生物无积毒性和遗传毒性，给生物机体补充茶多酚解毒时也不会引入新的毒性物质，这对于食物链顶端的人类而言是相当安全的[10]。目前将茶多酚作为畜禽饲料的食品添加剂也已在生产中得到了广泛应用[11]。研究发现，茶多酚可以与铜在可变电荷土壤表面发生协同吸附，增加土壤对铜离子的吸附量，从而降低这类有毒金属的活性[12]。同时蚯蚓作为评价化学品土壤污染生态效应研究的理想模式生物[13-17]，对土壤有机污染物比其他动物更加敏感[18-21]，是环境污染物生态毒性监测的“哨兵”生物。【本研究切入点】NP是类环境激素物质，具有生物致毒性，在水体、污泥、沉积物中普遍存在，且对食品安全构成威胁，但国内对土壤中壬基酚的残留水平知之甚少。目前针对NP在土壤中的研究已经有一些报道，包括吸附动力学[22]、纵向淋溶研究[23]、生物降解[24]等。然而目前有关NP对土壤生物生态毒性的研究却鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究以蚯蚓作为试验材料，研究NP胁迫下赤子爱胜蚯蚓（Eisenia foetida）的生态毒性效应，并探讨茶多酚对NP胁迫下蚯蚓生态毒性的缓解作用，以期为NP的防治奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

试验动物赤子爱胜蚯蚓（Eisenia foetida），购自福建省福州市国艺花鸟工艺品市场，试验前选择体重300～400mg环带明显、健康的蚯蚓，放在自然土壤培养盒中，置于生长箱中预培养2周以上后用于试验。试验温度为（20±2）℃，相对湿度≥80%;NP购自南京奥多福尼生物科技有限公司;助溶剂为无水乙醇，试验用土购白国艺花鸟工艺品市场，自然土壤为黑色砂壤土，pH为6.8，含水量35%。

1.2试验方法

1.2.1NP对蚯蚓的生态胁迫影响 试验蚯蚓预处理：洗去蚯蚓身上的泥土，放置于墊有湿润滤纸的培养皿中，用扎孔的保鲜薄膜封口进行一昼夜的清肠，清肠后选取依然健康的蚯蚓进行试验。毒性试验采用自然土壤法。设清水对照、溶剂乙醇对照组和NP染毒组。配置成质量分数为25、50、100、200、400mg·kg-1的NP试验用土，在100g试验用土中加入10条已清肠的蚯蚓，室温下培养14d。期间定期补充一定量清水维持土壤的湿度，观察并记录蚯蚓的生活状态及死亡情况（以针刺尾部无明显反应则判定为死亡）。

（1）毒性试验：毒性试验中的半致死质量浓度LC50和95%置信限采用寇氏法[25]，公式为如（1）所示：

LC50= log-1[Xm-i（∑P-0.5）]

（1）

式中，Xm是最大NP组的质量分数对数值，i是相邻两组对数质量分数的差值，P是各组蚯蚓死亡率，∑P是各组蚯蚓死亡率之总和。LC50的标准误：

=——————一

SX50=i× √（∑P-∑p2）/（n-1）

式中，n是各组蚯蚓条数。

LC50的95%置信限=log-1（logLC50±1.96×SX50）。

有害物质毒性分级采用表1的标准。

（2）生长抑制率：在试验第0、15d，收集存活的蚯蚓，清肠一昼夜后，称量蚯蚓体重，计算蚯蚓生长抑制率：

C=W0-Wt/W0×100%

（2）

式中，C为生长抑制率;W0为试验开始时蚯蚓体重;Wt第14d蚯蚓体重。

（3）体壁显微结构：取毒性试验14d中存活的蚯蚓，清肠24h，环带前方0.5cm处剪取一段组织，Bouin's固定液中固定24h，经过梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后进行连续切片，厚度为7μm，晾干。之后经二甲苯脱蜡，梯度酒精复水，苏木精、伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后显微镜下观察蚯蚓体壁显微结构。

1.2.2蚯蚓对NP的回避反应 回避容器中央放置2块相同的隔板，中间留有0.5cm空隙。取60g（干质量）土壤配成含NP12.5、50、200 mg·kg-1的试验用土，放置于隔板一端，取60g（干质量）土壤配置清水（或乙醇）对照组放置于隔板另一侧。于两隔板中间放置20条清肠后的蚯蚓，抽去隔板，以扎孔的保鲜薄膜封口。培养48h后将隔板插入原位置，阻止蚯蚓进一步逃逸，手动挑出两侧土壤中的蚯蚓并计数。当蚯蚓位于隔板中间的缝隙时，则两边按0.5条计算，每个质量分数设3个重复。回避率计算公式如下：

NR=[（C-T）/N]×100%

（3）

其中，NR为净回避率，C为在清水一侧的蚯蚓数目，T为在受试物（乙醇、NP、茶多酚）一侧的蚯蚓数目，N为加入的蚯蚓总数。

1.2.3茶多酚对NP胁迫下蚯蚓的缓解和回避行为的缓解作用 设置NP对照组和茶多酚试验组，以14d半数致死浓度95%置信下限的NP溶液为NP对照溶液，并在此NP溶液中添加茶多酚，配置茶多酚为0.7、7、70、700μg·kg-1的处理组，茶多酚对蚯蚓毒性损伤的缓解作用试验的具体方法见1.2.1和1.2.2。

1.3数据处理

运用SPSS 11.0系统软件分析数据资料，采用线性回归分析NP的质量浓度和毒性效应的关系，用相关系数R来表示相关程度。

2结果与分析

2.1NP对蚯蚓的生态胁迫影响

2.1.1NP对蚯蚓的致死毒性和生活状态的影响 结果显示：清水、乙醇对照组以及NP为25～50mg·kg-1组蚯蚓体表湿润，行动迅速，无中毒症状，无死亡情况;NP为100～200mg·kg-1时对蚯蚓具有一定的毒性作用，主要表现为生活状态较差，体型瘦小，应激运动能力较迟钝，体表较干燥，NP为100～200mg·kg-1时对蚯蚓具有一定的致死效应，且NP对蚯蚓的致死效应与染毒时间和染毒量均呈正相关（表2）;蚯蚓对400mg·kg-1的NP敏感，蚯蚓刚接触此量的NP土壤时即表现出强烈的回避反应，迟迟不肯入土，7d后的蚯蚓生活状态极差，反应及运动能力极为迟缓，体表干燥，同时此含量NP对蚯蚓具有强烈的致死作用，于染毒的第5d就开始发挥致死作用，第14d致死率达100%。以NP质量分数为横坐标对蚯蚓慢性致死率进行回归分析，结果见表2，结果显示第7d的LC50为292.817mg·kg-1，LC50>10mg·kg-1，按照土壤法毒性等级划分标准，NP对蚯蚓的毒性等级为低毒。

2.1.2NP对蚯蚓生长的抑制影响 图1显示了暴露于NP14d的蚯蚓生长变化趋势。结果发现：清水对照组和乙醇对照组中蚯蚓无生长抑制现象，与清水组比较，25mg·kg-1的NP也对蚯蚓的生长具有显著的抑制，而且，随着NP的升高，其对蚯蚓生长的抑制作用增强，200 mg·kg-1的NP对蚯蚓生长抑制率达34%，差异显著。

2.1.3NP胁迫对蚯蚓体壁结构的损伤 染毒14d蚯蚓体壁显微结果顯示：清水对照组角质层结构平滑、完整，表皮层柱状上皮细胞排列紧密，其中存在少许扩大空泡状的黏液腺细胞，环肌层厚度等于或大于表皮层厚度（图2-A）。乙醇对照组表皮层细胞略有增厚，环肌层厚度约等于表皮层厚度（图2-B）。与清水对照组相比，NP为25～50 mg·kg-1时，表皮层细胞增厚情况、环肌层厚度情况与乙醇对照组相似，25mg·kg-1NP组空泡化黏液腺细胞数量增多（图2-C），50mg·kg-1NP组空泡化黏液腺细胞数量没有增多，反而减少，少于清水对照组（图2-D），同时部分角质层开始破损脱落（图2-E）。100～200mg·kg-1NP组部分表皮层细胞增厚明显，环肌层变薄，厚度小于表皮层，表皮层空泡化腺细胞数量少（图2-F、H），同时100 mg·kg-1NP组的角质层薄而稀疏（图2-G），200mg·kg-1NP角质层破损严重，部分角质层已完全脱落，柱状上皮细胞裸露（图2-1）。

2.2蚯蚓对NP毒性的回避反应

蚯蚓回避试验草案[27]指出：当回避率（NR）为0时，污染物浓度为无效应浓度，当NR为负数时，表明蚯蚓对受试物无反应。当NR为正数时，表明蚯蚓对受试物具回避反应。计算回避率，当有80%以上的蚯蚓发生回避反应时，则表明受试物的存在不适宜蚯蚓的生存。NP胁迫下蚯蚓的回避试验结果（图3）显示，蚯蚓对12.5～200mg·kg-1的NP具有一定的回避反应，且蚯蚓对NP的回避反应随着NP的升高而加剧。试验期间没有发现蚯蚓死亡和逃逸现象。

2.3茶多酚对NP胁迫下蚯蚓的缓解作用

2.3.1茶多酚对NP胁迫下蚯蚓致死毒性的缓解作用

取毒性试验中14d时LC50的95%置信下限NP溶液质量分数（100mg·kg-1）为NP对照溶液，并在此NP溶液中加入不同茶多酚进行保护试验。结果表明（表3），NP对照组中的蚯蚓从第10d开始陆续死亡。加入茶多酚后14d，蚯蚓的死亡率显著降低，茶多酚为7～700μg·kg-1时蚯蚓死亡率为0，全部存活，同时茶多酚组的蚯蚓体色与活动能力等各方面的生活状态都有恢复。

2.3.2茶多酚对NP胁迫下蚯蚓生长毒性的緩解 图4结果表明，在NP液中加入茶多酚后，与NP对照组相比，茶多酚为0.7-7μg·kg-1时不能显著缓解NP对蚯蚓生长的抑制，但是茶多酚为70～700μg·kg-1时能显著缓解NP对蚯蚓生长的抑制。

2.3.3茶多酚对NP胁迫下蚯蚓体壁损伤的缓解作用

NP对照组中蚯蚓体壁角质层破损明显，环肌层薄，小于或接近表皮层厚度（图5）。各质量浓度茶多酚处理14d后，蚯蚓体壁角质层光滑完整，没有破损现象发生，环肌层厚度有所增加，大于或等于表皮层厚度，与清水对照组相似。

2.4茶多酚对NP胁迫下蚯蚓回避行为的缓解

茶多酚对NP胁迫下蚯蚓回避的保护试验结果（图6）表明土壤中添加0.7～7μg·kg-1的茶多酚能明显缓解蚯蚓的回避反应，7μg·kg-1茶多酚组蚯蚓回避率已为负值，表明蚯蚓对受试物无反应。但是加大茶多酚用量后，蚯蚓的回避率有了小幅上升。

3讨论与结论

本试验发现，NP对蚯蚓具有致死作用，且致死率随着NP用量的升高而增加。NP为400mg·kg-1时，受试蚯蚓全部死亡。这与许多化学污染物的毒性试验结果一致[28]。虽然蚯蚓对土壤中的NP具有蓄积性，但其蓄积具有动态变化的特征。Jun[29]利用14C追踪NP在威廉腔环蚓（Metaphire guillelmi）体中的蓄积，发现威廉腔环蚓在NP中暴露20d后，生物.土壤的蓄积因子为1.2，表明NP体内蓄积是蚯蚓急性及亚急性致死的首发原因。智勇等[30]同样利用威廉腔环蚓了解NP异构体在蚯蚓体内蓄积的动态变化时发现：威廉腔环蚓暴露7d时，蚯蚓对NP的蓄积受土壤中NP含量影响不大，7～28d，较高含量结合残留态NP在蚯蚓体内形成较快，28～56d结合残留态NP在蚯蚓体内持续累积。这种蓄积高峰的特点在本研究中依然存在，高量组的蚯蚓在第5d才开始出现死亡现象，但从第7d开始，每天在较低量NP中都有蚯蚓陆续死亡，死亡率与NP含量呈正比，表明污染土壤中NP在赤子爱胜蚯蚓体内蓄积达致死毒性阈值的作用时间发生在第5d。

蚯蚓的回避行为已广泛用于污染土壤生态的风险评价[24，28-33]。体重变化是非常敏感的指标，可反映污染物对机体生长的影响。本研究结果表明蚯蚓对NP污染的土壤具有回避行为，同时发现即使在远低于14dLC50的用量，NP也会造成蚯蚓体重的下调，表现为明显的生长抑制，表明了NP的胁迫对蚯蚓生态具有毒性作用，这与部分污染物对蚯蚓生长抑制的研究结果相一致[34]。

蚯蚓的体壁结构的变化是蚯蚓对土壤污染物毒性的早期、直接的反应[35]。本研究表明NP胁迫使蚯蚓体壁增厚、角质层破损甚至脱落、分泌的腺细胞先增多后减少，环肌层变薄。这与高玉红[36]在研究阿苯哒唑对蚯蚓皮肤的影响以及李辉龙[37]在1，2，4-三氯苯对蚯蚓表皮影响的研究结果是一致的。这些体壁结构的损伤使得蚯蚓失去了对外界化学污染物的有效抵御，后续化学污染物通过破损的皮肤直接进入体内作用靶点发挥毒性功能。有文献报道，生物体内，有毒物质的代谢将产生大量的活性氧，从而引起机体某些酶活性的改变与失活，当体内抗氧化防御系统不能消除机体产生的活性氧时，可引起机体的氧化应激，从而对机体产生损伤，所以细胞内许多抗氧化酶活性的改变和膜脂质过氧化的损伤被一致认为是许多毒物作用机制之一[34-35]。赵晓祥[38]在对NP胁迫下赤子爱胜蚯蚓体内抗氧化酶酶活的研究中发现：NP胁迫下，其体内SOD、CAT以及GST都表现为先诱导后抑制下降的变化规律，表明了生物体在遭受环境污染初期时抗氧化酶诱导表达激活，但随着污染物的持续暴露，抗氧化酶不能转化更多的毒性物质，最终表现为酶活力下降，从而导致了机体组织细胞的损伤。所以NP通过破损的体壁进人体内，引发细胞抗氧化能力下降可能是诱发蚯蚓生态毒性的原因之一。

茶多酚具有抗氧化性，拮抗重金属、脂肪酸毒性、神经元的氧化毒性等作用。本试验在NP液中加入茶多酚后发现蚯蚓的死亡率明显降低，7～700μg·kg-1质量浓度的茶多酚组中蚯蚓死亡率都为0，全部存活，表明茶多酚对NP所致蚯蚓致死毒性具有缓解作用。此外，加入茶多酚后不仅能改善蚯蚓对NP的回避率，也改善了NP对蚯蚓生长的抑制。对蚯蚓体壁的组织细胞观察发现：加入茶多酚后蚯蚓体壁的代偿性反应减小了，表现为体壁角质层光滑完整，环肌层厚度恢复正常。以上结果均表明茶多酚可通过保护蚯蚓的体壁而加强对NP的抵御能力，减缓或减弱NP对蚯蚓体内细胞的损害，从而缓解NP对蚯蚓所致的生态毒性作用。然而，茶多酚只在适当的质量浓度范围内才具有抗氧化作用，且对饲喂的动物无明显致死与生长抑制毒性;当超剂量使用时，清除自由基能力下降，毒副作用加强[39]。虽然高量的茶多酚不会对生殖细胞及遗传造成损伤，但能引起动物的急性死亡，所以对试验动物的致死作用是高质量浓度茶多酚最明显的毒副作用[40]。本研究结果也表明一定含量范围内的茶多酚具有缓解作用。

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（责任编辑：张梅）

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收稿日期：2020-04-08初稿;2020-07-14修改稿

作者简介：陈建华（1973-），女，博士，讲师，研究方向：遗传毒理（E-mail： jhchen@fjnu.edu.cn）

*通信作者：王国红（1967-），女，博士，教授，研究方向：动物生态（E-mail：guohongw@fjnu.edu.cn）

基金项目：福建省自然科学基金项目（2015J01125）：福建省自然科学基金引导性项目（2015N0027）