月季盐胁迫响应转录因子基因RcMYB102的克隆及表达分析

包颖 李泽卿 魏琳燕 陈超 付玲 张红心

摘要：为研究月季MYB类转录因子基因RcMYB102的生物学功能，以月季品种月月粉为材料，利用生物信息学分析和实时荧光定量PCR技术研究RcMYB102基因在盐处理、激素处理、盐加激素共处理下不同组织不同处理时间的表达特性。克隆得到一个MYB类转录因子基因，命名为RcMYB102，该基因全长为1 492 bp，开放阅读框（ORF）为1 086 bp，编码362个氨基酸。序列比对发现，RcMYB102在N端具有保守的R2R3-MYB结构域。系统进化树分析结果表明RcMYB102与梅花PmMYB6、桃PpMYB6、甜樱桃PaMYB102、苹果MdMYB74、枇杷EjMYB4处于同一分支，属于R2R3-MYB类转录因子。实时荧光定量PCR结果表明：在盐胁迫下，外施水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）可诱导RcMYB102的表达，且均高于单盐胁迫处理和激素处理。上述结果表明，RcMYB102可能与SA和MeJA信号转导途径相关，推测其在月季响应盐胁迫过程中起到一定的作用。

关键词：月季;盐胁迫;RcMYB102;实时荧光定量PCR;基因表达

中图分类号：S685.12文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）06-1521-08

Abstract： In order to predict the biological function of transcription factor gene RcMYB102 in Rosa chinensis， the Rosa chinensis Old Blush was used as the material， the bioinformatics analysis of RcMYB102 was conducted and its expression characteristics in diverse tissues under salt， hormone， and salt combined with hormore treatments were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. A MYB transcription factor gene in R. chinensis was obtained and named RcMYB102. The results of bioinformatic analysis showed that the full length of RcMYB102 gene was 1 492 bp， and the open reading frame（ORF） of RcMYB102 was 1 086 bp. Moreover， RcMYB102 gene encoded 362 amino acids. Results of sequence clignment revealed that RcMYB102 had a conserved R2R3-MYB domain at the N-terminal. Phylogenic tree analysis showed that RcMYB102 was clustered with PmMYB6， PpMYB6， PaMYB102， MdMYB74 and EjMYB4， and belonged to the R2R3-MYB transcription factor. Real-time PCR results indicated that， under salt stress， RcMYB102 was significantly up-regulated by salicylicacid （SA） and methyl jasmonate （MeJA）， and the expression levels were higher than those under salt stress treatment and exogenous hormone treatment. These results indicate that RcMYB102 may be related to signal transduction pathways of SA and MeJA， suggesting that RcMYB102 may play a role in response to the salt stress in R. chinensis.

Key words：Rosa chinensis;salt stress;RcMYB102;real-time fluorescence quantitative PCR;gene expression

在眾多的转录因子中，MYB类转录因子是数量最大、功能最多的转录因子家族之一。它们在植物的生长发育、次生代谢、激素信号转导和植物的非生物胁迫反应中都起着重要的作用[1-2]。在植物中，R2R3-MYB类型的MYB类转录因子数量较多[3]，且参与了植物的初生和次生代谢、植物细胞形态和模式建成以及植物生长发育等多个生命过程的调节[4-5]。

越来越多的报道证实MYB转录因子广泛参与植物逆境应答响应，包括生物逆境和非生物逆境，且与植物响应高盐胁迫密切相关[6-7]。在小麦（Triticum aestivum）中有14个MYB基因表达受盐胁迫诱导，2个MYB基因表达受盐胁迫抑制[8];水稻（Oryza sativa）中有14个MYB基因表达受盐胁迫诱导;拟南芥（Arabidopsis thaliana）中存在197个MYB基因，其中35.02%的MYB基因在盐胁迫下上调表达，56.85%的MYB基因在盐胁迫下下调表达[9];甜瓜（Cucumis melo）幼苗有6个MYB基因的表达量在盐胁迫下发生了明显的变化[10];在花生（Arachis hypogaea）的根中至少有8个MYB基因在盐胁迫下诱导表达[11]。大量研究结果表明，MYB转录因子还参与对植物激素的应答反应。如在大豆（Glycine max）中GmMYBJ6的表达受到脱落酸（ABA）、赤霉素（GA3）和萘乙酸 （NAA）的诱导[12];在甜樱桃（Prunus avium）叶片中PacMYBA的表达受盐、茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）的诱导[13]。大量研究结果表明水杨酸和茉莉酸作为重要的化学信号，均能激活很多防卫反应[14]。内源与外源的水杨酸、茉莉酸均有诱导植物的获得性抗性的作用，提高植物对生物和非生物逆境胁迫的抗性，如诱导月季抗黑斑病，缓解重金属对植物的毒害作用，提高植物抗盐胁迫能力等作用[15-16]。

月季（Rosa hybrida）是蔷薇科蔷薇属多年生常绿木本植物。月季被誉为“花中皇后”，是中国十大传统名花之一，是世界第一大切花和重要园林花卉[17]。切花生产中设施内土壤盐渍化问题限制了月季切花的品质和产量。此外，盐碱地区的环境胁迫严重制约了月季在当地园林绿化中的应用，高盐胁迫导致大多数月季品种生长不良、病虫害加重，严重影响月季的生长发育和观赏效果。目前对于月季耐盐性的研究远滞后于花色、花型、花香等其他农艺性状。国内外对月季抗盐性的研究主要集中在形态和生理水平上，而在分子水平上对于月季耐盐性的研究较少[18-20]。关于月季盐胁迫分子机理的解析和发掘抗盐的月季品系已成为当下首要解决的问题。大量研究结果表明在盐碱土中，植物在承受盐胁迫的同时还要抵御高pH胁迫伤害。NaHCO3或Na2CO3等碱性盐胁迫对植物所造成的破坏作用明显大于由NaCl或Na2SO4等中性盐所造成的胁迫伤害[21]。同时关于植物抗盐特性的研究多集中在草本植物，且多以NaCl为胁迫因子，关于NaHCO3胁迫下木本植物抗盐特性的研究相对较少[22]。

前期我们利用月季品种月月粉在高盐胁迫下的转录组测序数据，筛选获得1个表达水平具有显著性差异的MYB类基因RcMYB102。为验证月季品种月月粉转录因子基因RcMYB102是否参与高盐胁迫逆境应答，本研究分析RcMYB102基因对盐胁迫以及抗性相关的激素分子（MeJA和SA）的诱导表达模式，同时进一步对月季RcMYB102进行生物信息学分析，对其基本生物学功能进行预测，为深入剖析月季的抗盐机制和培育新的抗盐碱品种提供重要基因源和理论依据。

1材料和方法

1.1材料

中国二倍体古老月季品种月月粉（Rosa chinensis Old Blush） ，购自昆明杨月季园艺有限责任公司，并将其栽植于唐山师范学院温室内培养。选用生长状况良好、植株健壮、無病虫害、株高25 cm左右的当年生月季扦插生根的幼苗进行试验。

1.2材料处理

先在每个栽培槽中用10 L的1/2 Hoagland营养液缓苗1周。之后用全Hoagland营养液进行盐胁迫（200 mmol/L NaHCO3）、激素处理（1 μmol/L MeJA、200 μmol/L SA）和盐加激素共同处理（200 mmol/L NaHCO3+1 μmol/L MeJA、200 mol/L NaHCO3+200 μmol/L SA），每个处理分别在0 h、2 h、6 h、12 h、24 h、48 h对月季根系和叶片进行取样，-80 ℃冰箱中保存备用。每个处理5株，3次重复。盐处理浓度参照丁晗[23]的研究结果，MeJA处理浓度参照严加坤等[24]的研究结果，SA处理浓度参照付乃鑫等[25]的研究结果。

1.3总RNA提取与cDNA合成

RNA的提取采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，反转录获得cDNA的步骤参照Roche公司反转录试剂盒。上述操作过程均按照试剂盒说明书进行。

1.4RcMYB102基因的克隆

以月季品种月月粉生根的组培苗为材料，进行RcMYB102基因的克隆。根据前期盐胁迫转录组测序数据（SRA accession：PRJNA587482;ID：SUB6482523）和月季全基因组数据[26]，检索序列号RC5G0056400，以月季品种月月粉cDNA序列为模板设计CDS全长扩增特异引物（表1） ，并进行PCR扩增。PCR反应体系为10×KOD Buffer 5.0 μl，MgSO4 3.0 μl，dNTPs 5.0 μl，cDNA 1.0 μl，上、下游引物各1.5 μl，KOD Plus高保真酶1.0 μl，用无菌ddH2O补齐至20 μl。混匀离心后放于PCR仪中进行扩增。PCR反应程序：94.0 ℃ 2 min;94.0 ℃ 15 s，56.1 ℃ 30 s，68.0 ℃ 1 min，以上程序35个循环;68.0 ℃ 5 min，4 ℃反应终止。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用TaKaRa Mini BESTAgarose Gel DNA Extraction Kit 试剂盒（大连TaKaRa公司产品）回收目的条带，并与pMD18-T载体连接。连接产物转化大肠杆菌，蓝白斑筛选，挑取白色单菌落鉴定，根据菌落PCR结果，将鉴定出的阳性克隆交由诺赛生物工程有限公司测序。

1.5月季转录因子基因RcMYB102的生物信息学分析

根据前期盐胁迫转录组测序数据（SRA accession： PRJNA587482; ID： SUB6482523）和月季全基因组数据[26]，获取RcMYB102基因CDS和基因全长序列。根据所获得的RcMYB102基因cDNA和基因全长序列，使用DNAMAN软件分析RcMYB102氨基酸序列同源性，使用clutaLX进行氨基酸序列比对分析，使用MEGA 6.0软件进行系统进化树分析。

1.6实时荧光定量PCR分析

采用软件Primer5.0设计RcMYB102的实时荧光定量引物，内参基因为RcActin，引物序列见表1。RcMYB102基因的表达量在ABI7500荧光定量PCR仪上进行检测。20 μl反应体系：3 μl cDNA模板，1 μl上游引物，1 μl下游引物，10 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×），5 μl ddH2O。反应程序为：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸2 min，40个循环。每处理进行3次生物学重复和3次平行样重复。相对表达量采用2-△△Ct[△Ct=CtRcMYB102-CtRcActin，△△Ct=△Ct（x h）-△Ct（0 h）]计算，用SPSS软件进行统计分析。

SA和MeJA是植物中重要的信号分子，在植物防御反应中起着重要的作用。前人研究结果表明，MYB转录因子也参与了植物激素应答过程。如小麦的TaMYB4基因的表达受到了SA、ABA和MeJA的调控[35];在外源激素SA、ABA、MeJA和GA3处理下，白木香（Aquilaria sinensis）的AsMYB1、AsMYB2基因被诱导表达[36]。本研究结果显示，外源激素SA和MeJA都可以诱导月季RcMYB102基因的表达，且叶中的表达量相对较高，表明叶片对于外源激素SA和MeJA的响应更为敏感，RcMYB102基因主要在月季叶片中发挥生物学功能。

植物激素除了参与植物的生长发育，还会响应非生物胁迫如干旱、盐渍和低温等[37-40]。如外施适量的水杨酸和茉莉酸甲酯使龙须菜（Gracilariopsis lemaneiformis）中的HSP70、MnSOD、CA、NR基因的表达量提高，并且施用这2种激素均可以提高龙须菜抵抗高温的能力[41];在烟草（Nicotiana tabacum）中，外施SA時MYB类转录因子基因的表达量会显著升高，同时烟草中抗病相关蛋白质含量也会增加[42];Hussain等研究结果显示，外施赤霉素可以诱导拟南芥中MYB基因的表达，进而影响其花药育性和开花时间[43]。本研究对月季在高盐与SA共处理以及高盐和MeJA共处理下RcMYB102基因的表达模式进行了分析。结果发现在盐胁迫与外施激素共同处理下，在月季根和叶片中，RcMYB102基因的表达水平比高盐和激素单独处理时都要明显升高，且在盐胁迫下增施MeJA 较增施SA的诱导效果更加明显。前期研究结果也证明，盐胁迫处理48 h，月季品种月月粉幼苗基部叶片明显褐化死亡，外施MeJA和SA均可以减缓盐胁迫对月季品种月月粉幼苗的伤害[44]。由此可以推断MeJA和SA参与了月季品种月月粉响应高盐胁迫过程。本研究对RcMYB102基因的生物信息学和表达模式分析有利于揭示月季的耐盐机制，同时为月季遗传改良奠定基础。

4结论

本研究结果表明，作为典型的R2R3-MYB类转录因子RcMYB102，参与了月季盐胁迫响应和对激素SA和MeJA的应答过程，可能对月季体内激素信号的接受、传导和高盐胁迫应答机制具有重要的作用。该结果为深入剖析月季的抗盐机制和培育新的抗盐碱品种提供了重要基因源和理论依据。

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（责任编辑：张震林）