山豆根内生菌发酵苦参的化学成分研究

宋娜丽 张苇 张毅 张菊 杨丽萍 马克坚 蔡乐 赵霞

[摘要] 目的 研究苦参经山豆根内生菌发酵后，其化学成分的变化，分析山豆根内生真菌对苦参化学成分变化的影响。 方法 利用硅胶柱色谱、薄层层析硅胶板从发酵苦参中分离得到7个化合物并利用波谱技术鉴定其结构。结果 从发酵的苦参中分离得到7个化合物，分别是1H-3-醛基-吲哚（1）、β-谷甾醇（2）、苦参碱（3）、槐定碱（4）、N-苯乙基乙酰胺（5）、氧化苦参碱（6）、胡萝卜苷（7）。 结论 1H-3-醛基-吲哚（1）、N-苯乙基乙酰胺（5）首次从发酵苦参中得到，可能为发酵后产生的化合物。

[关键词] 苦参;内生菌发酵;化学成分;中药转化

[中图分类号] R285.5          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2020）33-0048-07

[Abstract] Objective To research the changes of chemical composition of sophora flavescens after fermentation by endophyte from radix sophorae tonkinensis， and to analyze the impacts of endophytic fungi from sophora tonkinensis on the changes of chemical composition of sophora flavescens. Methods Seven compounds were isolated from fermented sophora flavescens by silica gel column chromatography and thin layer chromatography silica gel plate， and their structures were identified by spectrum technology. Results Seven compounds were isolated from fermented sophora flavescens， which were 1H-3-aldehyde-indole （1）， β-sitosterol （2）， matrine （3）， sophoridine （4）， N-phenylethylacetamide （5）， oxymatrine （6） and carotene （7）. Conclusion 1H-3-aldehyde-indole （1） and N-phenylethylacetamide （5） were obtained from the fermented sophora flavescens for the first time， which may be compounds produced after fermentation.

[Key words] Sophora flavescens; Endophytic fermentation; Chemical composition; Transformation of traditional Chinese medicine

苦參为豆科植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，具有清热燥湿、杀虫、利尿的功能，用于热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下、阴肿阴痒、湿疹、湿疮、皮肤瘙痒、疥癣麻风;外治滴虫性阴道炎[1-2]。生物碱苦参碱（Matrine）和氧化苦参碱（Oxymatrine）是苦参中的主要活性成分。现代药理学研究表明，苦参具有燥湿、杀虫、利尿、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性[3-5]。在医药卫生领域的应用主要为抑菌、清热解毒、燥湿、抗炎、抗肿瘤、治疗失眠作用[6]。苦参常用的处方及制剂有苦参汤、复方苦参洗液、复方苦参注射液、苦参碱注射液、氧化苦参碱注射液等[7]。中药材经微生物发酵后，其化学成分及含量容易发生变化[8]，本研究对苦参进行微生物发酵，并分离鉴定其化学成分，以期讨论山豆根内生真菌对苦参化学成分变化及转化的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

1.1.1 实验仪器  核磁共波谱振仪（Bruker AVANCE 400 MHz， Bruker DRX-500 MHz， Brucker AVANCE Ⅲ 600 MHz，德国Bruker公司）;立式压力灭菌锅（YXQ-LS-SII系，上海博讯）;垂直层流洁净工作台（HKPL，深圳市华控净化有限公司）;电子天平（HCB-900V，海尔）;OSB-2200旋转蒸发器（上海爱朗仪器有限公司）;DLSB-5/25低温冷却液循环泵（郑州凯鹏实验仪器有限公司）;SHB-3循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）;ZF-1三用紫外分析仪（上海京工实业有限公司）;DBS-40电脑全自动部分收集器（上海泸西分析仪器厂有限公司）;隔水式恒温培养箱（GSP-9160MBE，上海博迅）;数控超声波清洗器（KQ-700DB型，昆山市超声仪器有限公司）。

1.1.2 实验试剂  二氯甲烷、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、磷酸、石油醚均为分析纯试剂。以上试剂均购自西陇科学股份有限公司。

1.1.3 实验材料  GF254薄层层析硅胶板（20 cm×20 cm，青岛海洋化工有限公司）、色谱柱填充硅胶（200～300目，青岛海洋化工有限公司），葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20，美国默克公司）;反相硅胶 RP-18（德国 Merck 公司）;薄层层析硅胶板（制备型，1 mm涂层，烟台江友硅胶开发有限公司）。

1.1.4 菌株材料  苦参干燥根，购于云南采云堂药业有限公司（批号170701），由云南省中医中药研究院陆宇惠主任药师鉴定为苦参。植物内生真菌（代号：SDG-15）为从山豆根中提取分离得到，各内生菌分别发酵苦参。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养发酵[9]  取山豆根中分离得到的内生菌，使之在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）上进行活化，随后进行扩大发酵，在28℃培养箱中培养7 d后备用。苦参药材用粉碎机打碎至蓬松状态，每份称取10 g装于发酵瓶。加超纯水充分浸润，使药材刚好完全湿润。设空白对照和阴性对照，粉碎药材后不加水、不进行高压灭菌处理为空白对照。粉碎药材，加水隔夜放置，充分浸润药材后，高压灭菌不接种内生真菌为阴性对照。设置每瓶编号分别为A1～A10，空白对照1、空白对照2、阴性对照1、阴性对照2，隔夜放置。除空白1、空白2外，高压蒸汽灭菌（121℃、30 min）后取出冷却备用。再取山豆根内生真菌，在洁净工作台中，将活化后的内生菌菌丝分别接种到冷却的苦参药材上，为防止操作过程中被空气中杂菌污染等原因，每株内生菌分别接种2瓶苦参药材，于28℃恒温培养箱中培养30 d。

1.2.2 发酵物的提取分离  待30 d固体发酵完成，查看每瓶发酵物状态，肉眼观察，查看菌落和菌丝形态、分布是否均匀、颜色是否一致等，取未被杂菌污染且发酵状态良好的发酵药材，于每瓶发酵物中加入200 mL甲醇和5 mL氨水。过夜浸泡，超声提取30 min/次，3次/样（功率：1700 W）。合并提取液，减压除去溶解得到提取物7.2 g。提取物进行硅胶柱层析，依次以二氯甲烷/甲醇/氨水的混合溶剂（50∶1∶0.1;20∶1∶0.1;5∶1∶0.1）洗脱，得到三个馏分Fr.1（1.6 g）、Fr.2（2.7 g）、Fr.3（1.8 g）。分别对三个馏分进行凝胶柱层析除去色素，进一步用制备型薄层层析硅胶板分离。从馏分Fr.1分離、浓缩、干燥得到化合物1（3.1 mg）、化合物2（3.5 mg）;从馏分Fr.2中分离得到化合物3（3.6 mg）、化合物4（4.8 mg）、化合物5（2.9 mg）;从馏分Fr.3中分离得到化合物6（6.7 mg）、化合物7（4.8 mg）。

2 结果

2.1 化合物结构鉴定

化合物1：淡黄色油状，1H-NMR（600 MHz，MeOD，δ，ppm，J/Hz） 9.89（1H，s，-CHO），8.17（1H，d，J=7.74 Hz，H-8），8.10（1H，s，H-3），7.48（1H，d，J=8.04 Hz，H-5），7.28（1H，dt，J=7.08，1.14），7.24（1H，td，J=7.86，1.02）。13C-NMR（600 MHz，MeOD，δ，ppm，J/Hz）187.4（s，-CHO），139.7（s，C-2，C-9），130.9（d，C-7），125.0（d，C-5），123.6（d，C-6），122.4（d，C-3）。以上波谱数据与文献[10]报道一致，鉴定该化合物为1H-3-醛基-吲哚。见图1。

化合物2：白色针晶。其分子式：C29H50O;分子量：414。1H-NMR（400 MHz，CDCl3，δ，ppm）：3.51（1H，m，H-3），5.35（1H，rn，H-6），0.67（3H，s，H-18），1.02（3H，s，H-19），0.92（d，J=6.4 Hz，Me-21）;13C-NMR（100 MHz，CDCl3，δ，ppm）：37.2（t，C-1），31.6（t，C-2），71.8（d，C-3），42.4（s，C-4），140.9（s，C-5），121.8（d，C-6），31.7（t，C-7），31.8（d，C-8），51.1（d，C-9），36.4（s，C-10），21.0（t，C-11），39.6（t，C-12），42.2（s，C-13），56.7（d，C-14），24.2（t，C-15），28.2（t，C-16），55.9（d，C-17），11.9（q，C-18），19.3（q，C-19），36.1（d，C-20），18.7（q，C-21），33.9（t，C-22），26.0（t，C-23），45.8（d，C-24），29.6（d，C-25），19.8（q，C-26），19.0（q，C-27），23.0（t，C-28），12.0（q，C-29）。以上核磁数据与文献[11]报道一致，鉴定该化合物为[β-谷甾醇（β-sitosterol）][1]。见图2。

化合物3：黄色粉末，取标准品，经薄层色谱（TLC）点板，比较比移值，经碘显色、硫酸显色反应判断，鉴定为苦参碱。

化合物4：黄色粉末，取标准品，经TLC点板，比较比移值，经碘显色、硫酸显色反应判断，鉴定为槐定碱。

化合物5：淡黄色液体，1 H-NMR（600 MHz，CD3OD， δ，ppm，J/Hz）7.25～7.28（2H，m，Ar 2，6-H），7.17-7.20（3H，m，Ar 3，4，5-H），3.37（2H，m，H-α），2.78（2H，m，H-β），1.90（3H，s，CH3）;13C-NMR（150 MHz，CD3OD，δ，ppm）172.9（CO），140.5（s，C-1），129.7（d，C-3，C-5），129.5（d，C-2，6），127.3（C-4），42.1（t，C-α），36.3（t，C-β），22.6（CH3）。经文献[12]对比，鉴定该化合物为N-苯乙基乙酰胺。见图3。

化合物6：黄色粉末，经TLC比较，取标准品，经TLC点板，比较比移值，经碘显色、硫酸显色反应判断，鉴定为氧化苦参碱。

化合物7：白色粉末。其分子式：C35H60O6，分子量：576。1H-NMR（400 MHz，C5D5N，δ，ppm）：5.34（1H，brs，H-6），5.01（1H，d，J=7.2 Hz，H-1′），0.99（3H，d，J=4.5 Hz，H-21），0.93（3H，s，H-19），0.88（6H，d，J=6.3 Hz，H-26，27），0.67（3H，s，H-18）;13C-NMR（100 MHz，C5D5N，δ，ppm）：38.4（t，C-1），29.4（t，C-2），79.42（d，C-3），40.25（t，C-4），141.86（s，C-5），122.7（d，C-6），33.1（t，C-7），33.0（d，C-8），51.2（d，C-9），37.8（s，C-10），22.2（t，C-11），40.9（t，C-12），43.4（s，C-13），57.7（d，C-14），25.4（t，C-15），27.3（t，C-16），57.2（d，C-17），13.0（d，C-18），20.8（t，C-19），37.3（t，C-20），19.9（d，C-21），35.1（d，C-22），24.3（q，C-23），46.9（q，C-24），31.1（q，C-25），20.3（q，C-26），20.17（t，C-27），30.4（q，C-28），12.9（q，C-29），103.5（d，C-1′），76.2（d，C-2′），79.2（d，C-3′），72.6（d，C-4′），79.1（d，C-5′），63.7（t，C-6′）。以上核磁数据与文献[13]报道一致，鉴定该化合物为胡萝卜苷。见图4。

3 讨论

本研究对苦参经山豆根内生菌发酵后的化学成分变化进行初步研究。经TLC比较，在苦参饮片提取物中未检测到1H-3-醛基-吲哚（1）和N-苯乙基乙酰胺（5）。对苦参中是否含有这两个化合物，相关文献中也未见报道。基于此，笔者认为1H-3-醛基-吲哚（1）和N-苯乙基乙酰胺（5）的产生很可能与内生真菌的代谢作用有关。

微生物转化是降低中药毒性、提高中药活性成分的重要途径之一[14]。研究发现菌株种属不同，中药种类不同，转化效果也不一样[15-17]。生物碱是一类含氮有机化合物，存在于植物中，具有镇痛、抗菌抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种药理作用，但直接从植物中提取生物碱产量低、浪费中药资源。研究发现，植物内生真菌如青霉、曲霉、格孢菌等转化生物碱能力强。同时，真菌转化可使生物碱的毒性降低，药效增强，如毒性较大的乌头碱、马钱子碱等成分的转化，其过程或与真菌释放的多种活性酶有重要关系。如笔者所在实验室前期发现的罗杰斯无性穗霉，促使卟啉生物碱转化为4R-羟基卟啉生物碱，采用液体发酵耗时短，转化率极好，产物抗肿瘤效果好，水溶性大大增加，解决了抗肿瘤药物水溶性不好的难题，为研发水溶性乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂提供了新途经[18]。另外，有利用短刺小克银汉霉AS3.0970转化苦参碱的报道，使之转化成羟基苦参碱、13，14-二羟基苦参碱、13-羟基苦参碱的报道[8]，得到的苦参碱衍生物具有抗肿瘤活性，这也为抗肿瘤等新药研发提供了很好的基础支撑。后期本课题将对发酵后的苦参药理作用及活性方面做进一步的深入研究。

通过对内生菌的鉴定发现，产喹诺里西啶类生物碱菌株多为镰刀菌属。文献报道[19]，苦豆子多种内生菌诱导子能提高宿主中喹诺里西啶生物碱的含量，筛选出8株优势菌，增长最高的是对照组的2.07倍，与对照组相比差异明显。可见，内生菌种属的多样性及自身特点，会使不同的发酵中藥在种类和含量方面产生不同的转化结果。

本研究重点探索主要成分及有效成分为生物碱的山豆根中内生真菌发酵转化苦参后，苦参中已知生物碱化学成分的改变、变化及是否产生新颖结构的生物碱。生物碱是微生物发酵后次生代谢产物中产生的重要化学成分之一，目前已经从代谢产物中分离到不同类型的生物碱，并且具有较好的生物活性[20]。从研究的情况来看，植物内生真菌发酵后次生代谢产物的研究是植物化学成分研究及资源开发利用领域的重要拓展和补充，已经成为发现结构新颖、活性较强生物碱的一个重要来源，也为新药的前期开发提供有效的思路。笔者随后将对发酵后的苦参化学成分及生物活性进行更深入的研究。

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（收稿日期：2020-07-31）