病原真菌的检测技术进展

王月华，胡珊，杨英

1.军事医学研究院 辐射医学研究所，北京 100850；2.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；3.徐州市肿瘤医院 检验科，江苏 徐州 221005

真菌在自然界中广泛存在，也是人体皮肤、黏膜定殖的常见菌。与其他常见病原微生物如细菌、病毒、衣原体、支原体不同，真菌是真核生物，有完整的细胞核、核膜、细胞质、细胞膜、细胞壁[1]。当人体的免疫系统受损时，真菌会侵犯皮下组织、内脏，进入血液、脑脊液，引起侵袭性真菌感染或称为深部真菌病，主要包括念珠菌、隐球菌、曲霉、毛霉、青霉、马尔尼菲篮状菌、孢子丝菌等。

近20 年，由于广谱抗生素大量使用、激素和免疫抑制剂的应用，以及侵入性治疗的增加，侵袭性真菌感染的发病率不断上升[2-3]。许多疾病如艾滋病、糖尿病、肿瘤等都合并有真菌感染，2019 年底由新型冠状病毒SARS-CoV-2 引发的COVID-19 肺炎患者中也发现伴随真菌感染[4]。据美国CDC 数据显示，近年来出现的多重耐药的耳念珠菌感染患者的死亡率为30%～60%[5]。真菌感染的早期发现和准确鉴定对于临床真菌治疗以及流行病学研究意义重大。与其他微生物相比，真菌的结构更加复杂，拥有坚固的细胞壁，而且真菌感染无特异性临床表现，极易导致漏诊误诊，因此真菌检测技术的研发及转化应用十分重要。本文旨在探讨真菌感染相关检测技术及其存在的优势和不足，包括表型鉴定技术、血清学检测、分子生物学技术、光谱技术等，并对真菌检测新技术的未来进行了展望。

1 表型鉴定技术

临床真菌的表型鉴定技术主要包括培养法和涂片镜检法，通过观察真菌的形态学特征进行检测。传统培养法是公认的病原体检测“金标准”，对培养条件进行改进能提高病原体检出的阳性率，例如采用不同的温度、pH 值、盐浓度、培养基成分等[6]。另外还有一些真菌显色培养基，可以通过培养物的颜色判别不同种的念珠菌。但是仍存在培养周期长、检出率低、假阴性等问题，并不适用于真菌快速检测。

涂片镜检法相比培养法更加快速简单，但受主观因素影响较大，对于操作人员也有一定的要求[7]，容易漏检而且不易判断菌种。常用的方法为生理盐水法和KOH 法，此外染色涂片镜检中苏木素-伊红（HE）染色、乳酸酚棉兰染色、嗜银（GMS）染色、过碘酸-希夫（PAS）染色均可用于多种致病真菌，荧光染色（CFW）法相比其他镜检方法观察时形态结构更加清晰，但成本较高[8-10]。墨汁染色法用于检查分泌物涂片或脑脊液中的隐球菌，但与其他染色方法不同，该方法属于负染色法，并未将真菌着色，不适合用于黏稠的呼吸道分泌物[11]。近年来镜检技术有新的发展，Liu[12]等研究发现，通过结合人工智能技术（AI）处理显微图像，可以用于疾病诊断。

2 血清学检测

血清学检测主要包括抗原检测和抗体检测两大类[13-14]。抗原检测最常用的是G 实验和GM实验以及隐球菌抗原和念珠菌抗原检测，抗体检测主要包括曲霉及念珠菌的抗体检测。

2.1 抗原检测

2.1.1 G 试验 G 试验检测靶标为真菌细胞壁上的（1，3）-β-D 葡聚糖，其他微生物、动物和人体中不存在此特异性抗原，当受到真菌感染时可以通过检测血液中的（1，3）-β-D 葡聚糖来判定。该方法操作简单，能够检测出多种真菌，如念珠菌、曲霉、镰刀菌、毛孢子菌等[15]。但是G 试验也存在其缺点，例如无法检测隐球菌、毛霉菌、根霉菌等，在一些特殊患者检测过程中存在假阳性结果，还会与革兰阳性细菌的细胞壁发生交叉反应等[16]。

2.1.2 GM 试验 GM 试验检测靶标为真菌细胞壁上的半乳甘露聚糖，也是真菌的一类特异性抗原成分，可以通过半乳甘露聚糖的释放量来反应感染的程度，目前主要用于侵袭性曲霉病的早期诊断[17]。乳胶凝集法（LA）、放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）是GM 试验常用的方法。GM 试验检测速度快且操作简单，还可用于监测抗真菌治疗的疗效。但其仍然存在一定的局限性，首先其特异性和灵敏度较低，其次由于抗真菌治疗会导致真菌细胞壁释放的半乳甘露聚糖更少，故GM 试验对于经验性抗真菌治疗的患者灵敏度和准确率可能会降低[18]。

2.1.3 隐球菌抗原及念珠菌抗原检测 新生隐球菌和格特隐球菌分泌一种荚膜多糖抗原（CrAg），可通过乳胶凝集法在血液或脑脊液中检测[1]。念珠菌细胞壁中包含甘露聚糖，可用于检测侵袭性念珠菌，但由于该抗原易被快速清除，所以有必要重复采样并不断优化检测技术[7]。

2.2 抗体检测

采用靶向真菌的特异性抗体进行检测，常用方法包括酶联免疫吸附法、补体结合法及免疫扩散法，主要用于慢性坏死性肺曲霉病、念珠菌感染[11]等。目前已有多种真菌抗体检测试剂盒[10]，如曲霉抗体检测试剂盒和念珠菌抗体检测试剂盒。曲霉IgG 类抗体是机体应对侵袭性曲霉菌感染产生的非保护性抗体，通过检测这种抗体可用于辅助诊断。但是抗体检测也有一些缺点，当患者免疫力低下时无法检测出抗体，还会与抗原产生交叉感染，并且对于侵袭性曲霉病、念珠菌病和隐球菌病的效果不如抗原检测效果好[19-21]。

3 分子生物学技术

真菌感染的快速诊断对于临床治疗十分重要，然而传统方法却不断显现局限性，无论是培养法、涂片镜检法还是血清学检测，都很难实现更精准的菌种鉴定以及定量检测。随着现代医学技术的不断发展，涌现了越来越多的分子生物学检测技术，包括PCR 检测、SNP 标记、核酸杂交、等温扩增、测序、质谱等。但是与其他微生物病原体相比，真菌病原体样本采集位置多样，且真菌有坚硬的细胞壁，在样本的前期处理过程中需要有效的破壁手段，因此分子检测相比其他微生物有一定难度。

3.1 基于PCR的技术

采用真菌的高度保守区域设计通用引物，通过PCR 扩增目的片段进行物种判定[22-23]。可以选择的靶基因包括 18S rRNA、28S rRNA、5.8S rRNA 及内转录间隔区（ITS）、基因内间隔区（IGS）、蛋白质编码区和一些管家基因[24]，最常用的为ITS 序列和28S rDNA 的D1-D2 区域。PCR产物还可通过测序进一步分析变异位点并进行溯源。PCR 检测速度快，灵敏度和特异性均很高，可用于多种真菌的鉴定。但须注意的是，相比其他微生物病原体，对真菌应采取有效的破壁技术提高核酸提取效率。此外，PCR 操作过程中需要注意样品的污染问题[25]。基于PCR 的技术包括实时荧光定量PCR、多重PCR、PCR-RFLP 等。

3.1.1 实时荧光定量PCR（qPCR） 加入荧光探针或嵌入染料对PCR 反应进行实时监测，分析相应的标准曲线对所测样本进行判定[26]。与常规PCR 相比，荧光定量PCR 在封闭体系中进行，后处理步骤较少，可以显著提高灵敏度且能够实现量化，目前已有用于检测念珠菌感染的qPCR 试剂盒，但试剂及仪器价格还较昂贵[27]。

3.1.2 多重PCR 利用不同的特异性引物同时扩增不同的DNA 片段，可用于多种病原微生物的同时检测，与传统PCR 相比更加高效快速且经济简便[26-28]。Schauwvlieghe[29]等已经证明多重定量PCR可用于检测曲霉菌，并发现曲霉菌中的cyp51A 位点突变。此方法需要很好地设计多对引物，保证相互没有干扰，并筛选出合适的PCR 体系适应于所扩增的多个序列。

3.1.3 PCR-RFLP 将PCR 和限制性酶切结合，PCR 扩增目的片段后，扩增产物再用限制酶切割成不同大小的片段，最后通过凝胶电泳观察所得特定片段用于鉴定真菌。PCR-RFLP 可用于分析从纯培养物和临床样品中获得的DNA，并可检测多种致病真菌如念珠菌、毛霉菌和曲霉菌等[27]。但是由于PCR-RFLP 包含多个步骤，包括电泳分离和限制酶消化，因此存在污染的风险且操作时间长。此外，RFLP 分析需要大量的数据库，这会影响其在临床中的常规使用。有一种类似的方法为扩增片段长度多态性（AFLP）[30-31]，颠倒了PCR 和限制性内切酶切割的顺序，该技术已被广泛用于评估种内变异并鉴定不同的真菌，例如临床分离的念珠菌等。目前在流行病学研究中主要用于评估物种内的遗传变异，可用于分离株的基因分型。

3.2 单核苷酸多态性标记（SNP）

SNP 是指由单个碱基的改变引起的核苷酸变异而形成的DNA 序列多态性，SNP 的检测具有很高的临床价值[32]，可通过 PCR、DNA 测序、MALDITOF-MS 等进行检测。基于PCR 的方法检测特异性高，可以根据SNP 位点设计特异性引物，或设计能够区分变异扩增片段的特异性核酸内切酶进行消化切割（PCR-RFLP）。DNA 测序是最容易实施的SNP 检测方法，通过序列比较研究基因碱基的变化，可以得到SNP 的位置及类型。MALDITOF-MS 通过检测PCR 产物的精确分子量并与数据库对比，通过分子量差异来确定SNP 类型。Oliveira[33]等用SNP 标记检测临床标本中提取的烟曲霉DNA。

3.3 核酸杂交技术

采用核酸探针检测DNA 或RNA 的特定基因序列，包括印记杂交技术（Southern 杂交、Northern杂交）、荧光原位杂交、基因芯片技术等[34]。印迹杂交技术利用硝酸纤维素膜或尼龙膜吸附DNA或RNA 进行杂交，是核酸杂交技术中较传统的方法，存在操作繁琐、效率低、检测序列少、自动化程度低的缺点。荧光原位杂交（FISH）是一项基于荧光探针的技术，可与微生物DNA 特定区域杂交，通过流式细胞仪（FC）或荧光显微镜进行检测，在FISH 的基础上还发展了肽核酸（PNA）FISH，该技术使用不带电荷的肽核酸作探针，拥有极好的生物稳定性，能够产生更强的结合力和更有效的反应，速度快，已经用于检测念珠菌[35]。基于分子的等位基因特异性探针技术也已经广泛用于病原体检测和耐药性评估，如分子信标和小的茎环结构DNA 寡核苷酸[36]。基因芯片技术具有高通量、高灵敏度的特点，其灵敏度和特异性受探针设计的影响，决定探针优劣的主要因素是其长度和位置，要尽量避免非特异性杂交[37-38]。

3.4 等温扩增技术

等温扩增技术不需要温度循环或热稳定的聚合酶，因此它不依赖复杂的仪器且操作时间短，可以大大降低仪器成本并具有便携性。主要方法有滚环扩增（RCA）、环介导等温扩增（LAMP）和核酸依赖性扩增（NASBA）[35]。RCA 是基于滚动循环复制的技术，它通过引物和环状DNA 模板合成，通常与圆形（挂锁）探针（RCA-挂锁探针）一起使用，以提高特异性和敏感性。RCA 反应快速且抗污染，目前可用于检测毛霉菌和隐球菌的基因型[27]。LAMP 主要通过DNA 聚合酶以及2 段特异性引物来进行扩增，在等温条件（约 63℃）下 30～60 min 就可以完成核酸扩增，操作简单，成本低，敏感性高，结果可以采用检测荧光强度和浊度进行鉴定[39-40]。LAMP 已被用于检测病原真菌，如白念珠菌和巴西副球菌等[27]，低成本、高特异性和快捷使其成为检测临床样品真菌感染最具前景的技术之一。NASBA 是一种在恒定温度下连续扩增RNA 的技术，具有实时检测功能的NASBA 已用于细菌和病毒，已经有研究对其进行了测试，认为可以用于检测念珠菌[41]。

3.5 DNA测序技术

基于序列分析的真菌鉴定可以说是真菌分子鉴定的“金标准”，公共数据库（如GenBank）中有大量真菌序列信息，测序比对成为极强大的诊断工具[27]。靶序列通常为ITS 区域和28S rDNA 的D1-D2 区 域，Sidiq[42]等 研究 证明 PCR 分析 和测 序分析在真菌临床试验中的应用有助于快速诊断和分析培养结果中的假阴性现象。DNA 测序技术中的宏基因组测序技术，可将环境中所有的DNA 作为研究对象，不必进行复杂耗时的分离培养，主要利用二代测序技术和生物信息学分析检测环境中所有基因的总和[43]。目前DNA 测序已得到广泛使用，但由于测序仪和分析系统需要较多的资金投入和专业知识，DNA 测序诊断尚未广泛商业化。

3.6 质谱法

3.6.1 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS） MALDI-TOF-MS 是将样本的质谱峰与数据库中参考质谱的特征峰进行比较来检测，不仅可用于蛋白质、寡核苷酸和单基因核苷酸多态性的高通量分析，还可以直接鉴定真菌蛋白和耐药菌株[44]。MALDI-TOF-MS 已经在鉴定曲霉菌、念珠菌、隐球菌、双相真菌以及一些皮肤癣菌中取得成功[45]，多项研究也表明其是鉴定许多不同酵母以及重要丝状真菌的最准确、快速的工具之一。与传统技术相比，MALDI-TOF-MS能够在短时间内产生结果，并且适合于高通量鉴定，还可用于追踪菌株的地理起源。缺点是仪器昂贵，并需要分离培养出菌株再进行测定，由于数据库中缺少某些菌株的参考质谱还易导致误诊，因此并没有在临床诊断中广泛使用[46]。

3.6.2 PCR/ESI-MS 电喷雾电离质谱（ESI-MS）通常与PCR 结合用于真菌检测。PCR 检测技术的灵敏度和特异性很高，但一次检测覆盖物种范围有限，当与ESI-MS 结合时，可用于广泛鉴定且同时保持PCR 的灵敏度[47]。主要通过设计多对引物来覆盖一组生物进行检测，PCR 扩增的产物进入质谱仪，获得不同产物的分子质量，可确定每个扩增产物的碱基组成，并将其与已知数据库进行比较以确定菌种。Wang[48]等采用商用仪器PLEX-IDTM 系统进行了研究，其中PCR 扩增试剂盒包含16 对引物和5 个分子靶标，PLEX-ID 通用生物传感器平台将扩增产物进行自动脱盐、信号收集、频谱分析和数据报告生成。该检测技术用于鉴定酵母和霉菌，有高精度、特异性和灵敏度的特点。但同样存在质谱仪器昂贵和数据库不足的问题，须进一步优化以适用于临床[49]。

4 光谱法

真菌光谱检测技术主要为红外吸收光谱和拉曼光谱技术。

4.1 傅里叶变换红外光谱（FT-IR）

红外吸收光谱技术中最常用的为FT-IR[50-51]，其分辨率高，基于红外光能量的吸收，反映生物大分子的分子振动信息，过程快速，易于操作，可应用于临床真菌检测。Mohammed[52]等分析了FTIR 在皮肤真菌和酵母菌诊断中的可能性，并肯定了它的应用价值。但是FT-IR 也存在一些不足，如后期需要对信息进行合理的化学计量处理、光谱数据库不全面等。FT-IR 的另一个缺点是水分子有较强的红外吸收，可能掩盖其他光谱特征并干扰光谱，因此用于FT-IR 的样品需要在早期进行干燥以避免水干扰[53-54]。

4.2 拉曼光谱技术

拉曼光谱是一种散射光谱，当散射光谱和入射光频率不同时，可分析得到分子振动信息，用于分子结构研究。蛋白质、糖类及核酸等大分子都能够产生特异的拉曼指纹光谱[55]。样品吸附在金属纳米颗粒上进行检测可增强拉曼光谱信号，称为表面增强拉曼光谱技术[56-57]。该方法可以避免或减少复杂的前处理过程中真菌失活，检测速度快，而且能够在接近自然的状态下研究生物大分子的结构及其变化，已用于检测皮肤癣菌、白念珠菌等，还须不断扩充光谱数据库。此外，紫外共振拉曼光谱法也逐渐用于真菌检测[58]。

5 新技术展望

5.1 纳米孔测序技术

基因组测序和核酸片段测序已经成为临床上越来越重要的诊断技术，但一代和二代测序设备需要较大的实验室空间和资本投入，而纳米孔测序技术能够较好地应对这些问题。目前已有多家公司开发了纳米孔测序仪[59]，如Oxford Nano⁃pore Technologies 的MinION 测序仪，最小体积约U盘大小，通过USB 端口与计算机连接，其优势是仪器便携、测序读长和检测快速，而且与其他测序仪器相比，价格更加便宜，因此纳米孔测序可能成为最有前景的测序技术。但是仍然存在一些不足，如会出现较多的测序错误等，还须进一步优化[27]。

5.2 人工智能技术

近年来中国在人工智能领域快速发展，人工智能技术越来越多地应用于医学领域，并发挥着越来越重要的作用[60]。传统的涂片镜检法对操作人员有较高要求且受主观因素影响较大，Liu[12]等将人工智能技术与显微观察相结合，使用数字图像处理和模式识别来获得真菌的特征，并使用人工神经网络（ANN）系统识别粪便样本中的真菌。将智能诊断系统应用于诊断，有望极大地减轻临床医生和影像医生的工作量，同时使患者能够获得早期诊断和及时治疗，具有十分广阔的发展前景。

6 结语

随着真菌感染病例的逐年增多，及时掌握和正确使用检测技术对于真菌感染的防治有重大指导意义。传统检测方法操作简单，成本较低，但耗时长，过多依赖人工。随着现代医学的不断发展，出现了越来越多的新技术，分子生物学检测潜力日益突出，新一代测序技术更加快速便捷，人工智能可协助医生诊疗，这些新技术都显示出巨大的应用前景[59-60]。通过对真菌检测技术的全面了解以及不断优化创新，真菌感染早期诊断的世界难题终将被攻克。