毓麟珠通过改善小鼠卵巢微环境防治早发性卵巢功能不全的作用机制研究

杨珍，冯逊逊，董晓英*

(1.首都医科大学中医药学院，北京 100069；2.首都医科大学基础医学院，北京 100069)

早发性卵巢功能不全(POI)是2016年欧洲人类生殖及胚胎学会(ESHRE)在女性过早卵巢功能不全的管理指南上提出的概念，是介于卵巢储备功能下降和卵巢早衰(POF)之间的一种卵巢低反应状态。卵巢内卵泡池减少和卵泡功能障碍是POI的典型表现，是一种严重的内分泌和生殖紊乱疾病[1]。临床特点是女性在40岁前出现至少4个月以上的闭经，每月监测血FSH，出现两次以上>40 U/L[2]。由于缺乏正常的卵泡排出，女性的月经和受孕受到影响，严重影响女性的生殖和身心健康。目前，POI的发病率呈上升趋势[3]。随着二胎政策的出台，这一疾病引起了越来越多学者的关注。目前，激素替代疗法在西方国家非常流行，但不能有效地促进卵泡的发育[4]。相反，中药治疗POI在改善卵巢功能、促进卵泡发育方面取得了良好的临床效果，引起了众多研究者的关注[5]。

临床中，我们通常使用动态超声监测卵泡。在基础研究中，超高分辨率的动物超声成像系统也可以无损伤地在小鼠身上完成这一过程。同时，与人体超声一样，超声血流参数也可以在动物身上进行测量。在本次实验中，我们选择采用古方毓麟珠(《景岳全书·妇人规》)作为治疗药物，动态观察其对免疫性POI卵巢形态、血流和卵泡发育的影响，结合卵巢微环境相关氧化因子的变化，动态、静态综合分析中药毓麟珠通过影响POI小鼠中发生的氧化应激反应改善卵巢微环境，进而改善卵巢功能的作用机制。

材料与方法

一、动物和材料

1.实验动物：SPF级BALB/c雌性小鼠7～8周龄40只，每只18～22 g，由北京维通利华技术有限公司提供(批号：SCXK 2012-0001)。

2.实验试剂：(1)阳性对照药：使用去离子水溶解戊酸雌二醇药片(拜耳，德国)。根据“人与动物体表面积等效剂量比例表”1 mg/(人·d)，换算小鼠服用剂量，使溶液中戊酸雌二醇浓度为0.009 mg/ml。(2)中药制剂：毓麟珠成分包括当归12 g、熟地12 g、菟丝子12 g、人参6 g、花椒6 g、白术6 g、炒白芍6 g、杜仲6 g、茯苓6 g、鹿角霜6 g、川芎3 g、炙甘草3 g。饮片购自北京同仁堂科技股份有限公司。根据“人与动物体表面积等效剂量比例表”煎煮，4℃冰箱保存。确定中药组每只小鼠按照体重每日给予中药等效剂量0.936 g/ml，0.3 ml/只。(3)造模试剂：根据小鼠透明带3(ZP3)的330～342个氨基酸序列(NSSSSQFQIHGPR)合成透明带，分析纯度>90%(杭州中肽)。称取6 mg ZP3透明带多肽粉溶于6 ml双蒸水中，取其3 ml与3 ml弗氏完全佐剂(F5506，Sigma，美国)混匀成免疫试剂，剩余3 ml透明带多肽溶液与3 ml弗氏不完全佐剂(F5581，Sigma，美国)混合均匀制成免疫增强剂。

3.实验设备：超高分辨率小动物彩色多普勒超声成像系统MS-550 D(Vevo 2100 Imaging System，Fujifilm Visual Sonics Inc，美国)，探头中心频率为40 MHz，最高分辨率为40 m。轴向分辨率为40 m，横向分辨率为90 m。捕获深度为11 mm，增益达25 dB。

二、实验内容

1.动物模型的建立：通过阴道脱落细胞涂片筛选出性周期正常的雌性小鼠40只。随机选择10只小鼠作为空白组，其余30只用于造模。每只小鼠于下腹部大腿根部、避开乳头处皮下注射0.15 ml Zp3多肽抗原剂。14 d后，每只小鼠皮下注射0.15 ml Zp3多肽抗原增强剂。造模期间，空白组每只小鼠予以皮下注射0.15 ml生理盐水[6]。

2.分组和管理：造模完成后将30只小鼠随机分成模型对照组、中药组和阳性药组，每组10只，加上空白组10只，共4组。阴道脱落细胞涂片显示周期紊乱提示造模成功，第15天开始灌胃。空白组和模型对照组给予生理盐水0.3 ml，1次/d；阳性药组每次0.3 ml戊酸雌二醇溶液，1次/d；中药组中药灌胃0.3 ml，1次/d，连续6周(休息1 d/周)。

3.高频小动物超声系统：(1)小鼠备皮与麻醉：麻醉前，先用脱毛膏去除小鼠背部及两侧探针扫描区域的背毛。脱毛完成后将小鼠置于超声专用台上，用麻醉面罩罩住小鼠的口鼻，调节异氟醚浓度到2.5%。麻醉后，调整小鼠体位，背部朝上呈俯趴位。将电极片附着在四肢(图1)。超声波平台固定在40℃的温度下，调节异氟醚，维持1.0%～1.5%的持续吸入量。在小鼠备皮区涂抹适量的超声波耦合剂，避免对检查区施加压力。(2)超声探头定位与二维超声成像：首先将探头放置在小鼠背外右侧表面上方2～3 mm处来回移动，以肾脏位于卵巢的头部一侧作为标记。探头与小鼠身体长轴平行竖直放置即可获得右侧卵巢二维超声图像的纵向截面。打开“旋转”按钮，保存整个右侧卵巢成像动态视频(每10秒300帧)。将探头旋转90°，与小鼠身体长轴垂直即可获得右侧卵巢二维超声图像的横断面，使用相同的方法保存动态视频。之后将探头移到小鼠背外左侧上方2～3 mm处，重复上述步骤，获得左侧卵巢成像。(3)卵巢血流图像的超声采集：将彩色采样框架放置在小鼠背部表面对应的卵巢区域上，调整入射角显示卵巢间质动脉。在卵巢基质中观察到动脉血流，其光谱通过脉冲多普勒显示采集小鼠卵巢血流图像，记录流速值。(4)超声影像测量及分析：在工作站对所获左右卵巢图像动态视频进行离线测量分析。二维图像：于长轴切面测量卵巢的纵径和前后径，短轴切面测量卵巢的横径和前后径；根据假设卵巢为椭圆体并按照椭圆体公式计算卵巢体积：卵巢体积(cm3)=纵径×横径×前后径×π/6。控制所获取的卵巢动态视频逐帧回放，保存每一帧图像并计数卵泡个数及测量卵泡大小。连续记录3～5个心动周期，分别测量卵巢动脉的收缩期峰值流速(PSV)、舒张末期流速(EDV)、阻力指数(RI)及搏动指数(PI)。

图1 超高分辨率动物超声成像系统检测小鼠卵巢

4.动物血液采集：给药6周后，心脏穿刺取血。小鼠血液标本静止，低温高速离心机离心3 000 r/min，取上清。小鼠腹腔V形剪开分离卵巢组织放入1.5 ml Ep管中，-80℃冰箱保存备用。

5.放射免疫测定：根据生殖激素试剂盒(南京建成)的说明，采用放射免疫法检测血清E2、FSH、LH和AMH浓度。

6.卵巢组织中超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)的测定：将子宫和卵巢组织切碎，加入蛋白裂解液，用自动研磨机将组织磨碎，4℃离心12 000 r/min，离心15 min后，吸取上清，用BCA法测定总蛋白浓度，酶标仪测定组织中MDA、SOD、GSH-Px的吸光度值，按试剂盒(南京建成生物)描述的蛋白浓度和标准曲线计算各指标的比值。

三、统计学分析

结 果

一、毓麟珠对POI小鼠卵巢面积和卵泡数的影响

给药5周后，与空白组比较，模型对照组卵巢面积缩小，卵泡数显著减少(P<0.05)；与模型对照组相比，阳性药组和中药组卵巢面积均增加(P<0.05)，阳性药组卵泡数无统计学差异(P>0.05)，中药组卵泡数显著增加(P<0.05)，且显著高于阳性药组(P<0.05)(表1、图2)。

表1 卵巢相对值(-±s)

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，#P<0.05；与阳性药组比较，△P<0.05

A：空白组；B：模型对照组；C：阳性药组；D：中药组。图A中，红色箭头示卵巢动脉，蓝色箭头示卵泡

二、毓麟珠对POI小鼠卵巢动脉血流速度和血流阻力的影响

给药5周后，动态监测卵巢血流。图3中，红色和蓝色区域代表卵巢中血流的分布，结果表明，各组卵巢血流均有不同程度的变化。模型对照组血流最弱，空白组血流最强，其余血流信号介于两组之间。从血流动力学指标看，模型对照组的脉压差、搏动指数和阻力指数均显著高于空白组(P<0.05)；与模型对照组比较，阳性药组和中药组的脉压差、搏动指数和阻力指数均有显著降低(P<0.05)，中药组比起阳性药组虽没有统计学差异，但可以看出中药组在降低血流指数方面具有较好的趋势(表2)。

表2 卵巢动脉血流速度和血流阻力(-±s)

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型对照组比较，*P<0.05

A：空白组；B：模型组；C：阳性药组；D：中药组

三、毓麟珠对POI小鼠血清生殖激素水平的影响

与空白组比较，模型对照组FSH、LH和AMH均有显著性差异(P<0.05)，AMH水平下降，FSH、LH水平升高，表明造模成功。与模型对照组比较，阳性药组E2、AMH水平升高，FSH、LH水平下降，均有显著性差异(P<0.05)；与模型对照组比较，中药组FSH、LH水平下降，AMH水平上升，均有显著性差异(P<0.05)；与阳性药组比较，中药组E2、FSH、AMH均有显著性差异(P<0.05)，表明中药组比起西药雌二醇治疗效果更加明显(表3)。

四、毓麟珠对POI小鼠卵巢微环境氧化应激指标的影响

与空白组比较，模型对照组SOD、GSH-Px下降，ROS、MDA上升，均有显著性差异(P<0.05)。与模型对照组比较，阳性药组ROS、MDA下降，SOD、GSH-Px升高，均有显著性差异(P<0.05)；与模型对照组比较，中药组ROS、MDA下降，SOD、GSH-Px升高，均有显著性差异(P<0.05)；与阳性药组比较，中药组ROS有显著性差异(P<0.05)(表4)。

表3 血清E2、FSH、AMH、LH表达水平比较(-±s)

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05；与阳性药组比较，◆P<0.05

表4 卵巢组织中ROS、FSH、MDA、GSH-Px和SOD表达比较(-±s)

注：与空白组比较，#P<0.05；与模型对照组比较，*P<0.05；与阳性药组比较，&P<0.05

讨 论

POI是由原始卵泡的抑制和激活引起的。研究表明，卵泡发育的能量主要来自氧化反应，过度氧化引起的氧化应激反应无疑是卵巢提前老化的原因之一。ROS是氧化应激的标志之一，在调节颗粒细胞的生长、增殖和凋亡方面发挥着重要的生物学作用[7]。因此，测定活性氧相关因子及其水平，可作为判断POI发生、发展和转归的依据[8]。卵巢微环境的改变引起血流周期性变化，影响卵泡发育中所需的营养物质和激素的输送。越来越多的研究表明，卵巢微环境的氧化应激可影响卵泡的发育，这是POI的根本原因[9]。卵泡的发育依赖于卵巢和卵泡微环境中能量平衡的维持。POI患者的卵母细胞和颗粒细胞对抗ROS的能力降低[10]。ROS作为细胞损伤的生理诱导剂，是衡量氧化应激反应的重要生理指标之一。在循环的月经周期中，只有有限数量的卵泡生长发育成熟排出，大多数生长中小卵泡不会达到排卵前阶段甚至经历闭锁，尤其是腔前和早期腔内阶段的卵泡[11-12]。这些因素加在一起会导致卵巢老化。当卵巢功能衰退为生育能力下降的主要决定因素时，我们有必要扩大对整个卵巢微环境的研究。因此，研究卵巢微环境的变化对预示卵巢功能是否良好有着重要的指导作用。

毓麟珠一方首见于(《景岳全书·妇人规》)，为临床上应用较多的调经方之一。全方12种药，包括：菟丝子、鹿角霜、花椒、杜仲和八珍丸。全方温补肾精，健脾生血，养血调经，注重肾阴肾阳平衡，动静结合，补气养血，滋补通气，益精助孕。临床研究发现，针对脾肾阳虚型POF的30例患者经过3～6个月给予古方毓麟珠的治疗，症状有了显著的缓解，血清激素水平得到了不同程度的改善，收到了较好的疗效，其对月经的影响可以在停药后依然维持，分析中药可能调控了自身的内分泌轴[13]。基础研究发现，毓麟珠通过上调卵泡及卵巢间质 Bcl-2 蛋白的表达，下调 Bax 蛋白的表达，抑制卵泡的过快凋亡，进而改善卵巢功能，有促进卵泡正常发育的作用[14]。

本研究结果表明，模型对照组小鼠FSH升高，AMH降低，这是判断卵巢早衰的标准，说明POI造模成功；ROS升高，SOD降低，说明POI小鼠卵巢微环境氧平衡紊乱，发生氧化应激；高频率小动物超声显示模型对照组小鼠卵巢面积缩小，卵泡数显著减少。给药6周后，阳性药组和中药组FSH降低，AMH升高，且中药组比阳性药组FSH及AMH水平有显著性改善。阳性药组和中药组ROS降低，SOD升高，中药组ROS比起阳性药降低显著，提示中药毓麟珠可显著改善氧化酶活性，缓解卵巢组织氧化失衡，改善卵巢微环境。

由于卵泡发育过程是动态的，因此超声动态监测对POI的测定起着重要作用。本实验进一步通过高频小动物超声动态观察小鼠卵巢结构和血流变化，模型对照组小鼠卵巢面积缩小，卵泡数显著减少，中药组和阳性药组卵巢面积和卵泡数均增加，中药组比阳性药组卵泡数增加更明显，表明毓麟珠对卵泡发育的作用比西药雌二醇的改善效果更好。高频小动物超声显示中药组小鼠卵巢血流指数均得到改善，表明毓麟珠可降低脉动指数、阻力指数和脉压，促进卵泡微环境的改善。

综合以上可以认为，卵巢微环境缺氧状态改善则有利于卵泡的发育。研究表明，处方中的熟地、菟丝子、杜仲、人参等多种药物均能提高过氧化物歧化酶活性，清除体内自由基，增强机体免疫力；当归和川芎能改善卵巢血流量[15]。因此，我们可以得出结论：中药毓麟珠通过改善卵巢微环境、促进卵泡发育对治疗免疫性POI有积极的作用。当然，毓麟珠具体通过影响哪些环节出现这种改变及作用靶点还不清楚，我们推测，这可能与某些通路的调节有关，还需要进一步的研究。