线粒体DNA量与胚胎质量及妊娠关系研究

倪梦霞，王玮，郑爱燕，丁洁，蒲艳，邹琴燕，孟庆霞，许咏乐，李红，偶健

(南京医科大学附属苏州医院 苏州市立医院 生殖与遗传中心，苏州 215002)

目前，染色体异常仍然是造成胚胎移植失败及流产的主要原因，而在染色体正常的胚胎中至少有30%左右依然无法获得成功妊娠[1]。这说明除了染色体外，还有其他因素影响IVF结局。胚胎发育是一个需要大量能量供应的动态过程，近年来，有研究表明卵母细胞中线粒体的分布变化可以通过调节ATP的生成来影响受精能力及胚胎的发育质量[2-3]。受精后，精子中的线粒体很快就会全部降解，胚胎中的线粒体几乎都来自于卵母细胞。若卵母细胞发生异常，可能会导致胞质内的ATP供求不平衡，主要表现为染色体分离障碍、细胞分裂障碍、受精障碍等[4-7]。线粒体与其他细胞器相比，最大的特征就是含有独立的遗传物质，还可以通过氧化磷酸化等一系列生化反应产生ATP。

由于卵母细胞中的线粒体数目呈动态变化，所以无法准确计算[8-11]。而现有的用以评估线粒体的指标包括线粒体DNA(mtDNA)的数量及突变、线粒体的结构/分布及跨膜电位、ATP水平、ROS水平等[4]。本研究通过采用二代测序(NGS)的方法检测mtDNA量，探讨mtDNA量与胚胎形态、基因组及妊娠的关系，希望可以结合植入前遗传学检测(PGT)技术筛查出质量较好的胚胎以供患者移植。

资料与方法

一、研究对象

选取2017年6月至2018年9月来自南京医科大学附属苏州医院生殖中心的293个周期1 071个囊胚。所有夫妇均签署了体外受精(IVF)和PGT知情同意书，医院生殖伦理委员会对此研究项目通过伦理审查。所用胚胎均由患者签订知情同意用于科研。

二、研究方法

1. 囊胚期胚胎形态学评估：根据Garnder囊胚评分法对囊胚期胚胎进行形态学评估。先根据囊胚的扩张和孵出程度将囊胚分成1～6期：1期：出现囊胚腔，扩张体积小于囊胚总体积的50%；2期：囊胚腔扩张体积大于囊胚总体积的50%；3期：囊胚腔占满整个胚胎，但还未充分扩张；4期：囊胚腔完全扩张，胚胎体积增发，透明带变薄；5期：扩张的囊胚从透明带的破口处孵出一小部分，未能完全脱出；6期：囊胚的内细胞团及滋养层细胞已从透明带中孵出。3～6期囊胚再对囊胚内细胞团细胞数目分级为A级(细胞数目多，结合紧密)、B级(细胞数目少，结合松散)、C级(细胞数目极少，不清晰)；根据3～6期囊胚的外滋养层细胞数目及排列形态分级为A级(细胞数目多，形态呈镰刀形且连续平铺在透明带内侧)、B级(数目少，排列松散，非连续姓平铺在透明带内侧)、C级(数目极少且几乎没有大的滋养层细胞)。形态学评分3BB及以上定义为优质胚胎，3BB以下为非优质胚胎。

2. 滋养层活检：所有胚胎在第3天用激光技术孵化，放入新鲜的培养基培养至第5天或第6天后，若胚胎已发育成完整的胚泡即可考虑进行活检。使用ZILOS-tk激光器(Hamilton Thorne BioSciences，美国)对胚泡滋养外胚层进行打孔后将囊胚再孵育4～6 h，待囊胚腔扩张，滋养外胚层细胞从透明带打孔处挤出后可进行活检。具体活检方法见参考文献[12]。

3. NGS-PGT：对所有活检样本进行全基因组扩增后建库。等温扩增和富集后，使用PGM测序仪(ABI Ion Torrent PGM，美国)进行测序。使用Ion Reporter software进行测序结果解读，通过界面分析数据或后台linux界面分析数据进行染色体分析，以此判断胚胎的染色体是否正常。

4. NGS-mtDNA：对PGT分析的数据(包含mtDNA和核DNA的混合物)进行优化计算[13]，通过将映射到线粒体基因组的读数除以映射到核基因组的读数，可计算出胚胎中的相对mtDNA量。每批样本的读数都需要进行校准，以减少NGS实验期间的差异性。

5. 移植策略：优先移植PGT结果正常胚胎。如果有多个PGT结果正常胚胎则结合形态学评估进行移植，优先移植形态学评分优质胚胎。如果无PGT正常胚胎可以移植，在充分遗传咨询的情况下可以考虑移植PGT嵌合结果胚胎。每次均移植一枚囊胚。

6. 分组分析：根据Garnder形态学评估分为优质胚胎组(n=652)和非优质胚胎组(n=419)；再根据PGT结果分为正常、异常、嵌合三个亚组。进行不同组间、亚组间的比较。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0进行统计学分析。组间比较采用独立样本t检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、mtDNA量与胚胎质量

形态学评分优质胚胎(3BB及以上)共652枚，非优质胚胎(3BB以下)共419枚。两组间mtDNA量无显著差异(P>0.05)，但两组中PGT正常结果亚组的mtDNA量均显著低于PGT异常结果亚组(P<0.05)；而两组中的PGT嵌合结果亚组的mtDNA量与其他两个亚组比较，均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同形态质量/PGT结果囊胚的mtDNA量(-±s)

注：与PGT正常结果亚组比较，*P<0.05

二、mtDNA量与妊娠

2017年6月至2018年9月这一时间段PGT正常的囊胚共移植了85枚(包括68枚优质胚胎，17枚非优质胚胎)。其余PGT正常囊胚处于冷冻状态，或者由于患者有多枚正常但只移植一枚，或者还未到患者召回移植时间暂时未移植。移植PGT正常结果组胚胎发现，妊娠结局为流产或者未孕的胚胎相比于正常妊娠组其平均线粒体DNA量在数值上较高，但无统计学差异(P>0.05)(表2)。以正常妊娠的平均mtDNA量0.086%作为切割值，低值组(mtDNA≤0.086%)的临床妊娠率为73.33%，高于高值组(mtDNA>0.086%)的妊娠率(67.5%)，但无统计学差异(P>0.05)(表3)。

表2 PGT正常结果组不同妊娠结局的胚胎mtDNA量(-±s)

表3 以mtDNA量0.086%为切割值的临床妊娠情况[n(%)]

有6个移植周期无PGT正常胚胎可以移植，在充分遗传咨询的情况下选择PGT嵌合结果胚胎进行移植。其中2个mtDNA量相对较高的胚胎1个未妊娠、1个流产，而另外4个mtDNA量相对较低的胚胎均正常分娩(表4)。

表4 PGT嵌合结果组胚胎mtDNA量与妊娠结局

讨 论

虽然辅助生殖技术在近几十年来飞速发展，但较多难题仍亟待解决。IVF的成功率依然较低，除染色体异常外，还有哪些因素会造成胚胎发育停滞？有学者认为卵母细胞中的线粒体质量会影响受精能力及胚胎发育质量[13-14]。线粒体作为卵母细胞中含量最丰富的细胞器，以“能量工厂”的身份为早期胚胎发育过程中的一系列细胞活动提供ATP。胚胎发育至囊胚期，ATP的产生上调以满足胚胎进一步发育和分化所需的能量[4]。但是由于线粒体呈动态分布，无法准确计算其数目，所以要研究线粒体与胚胎发育之间的关系，还需找到可以评估线粒体数目的指标。mtDNA作为线粒体所特有的遗传物质，在卵母细胞中每个线粒体只包含一个mtDNA拷贝[15]。当胚胎发育到不同阶段时，其拷贝数也会处于不同水平，因此可通过检测mtDNA量来评估线粒体水平[16]。

近年来，很多学者都密切关注mtDNA量与IVF成功率的关系。mtDNA由于不具备核基因的修复机制，也缺乏组蛋白的保护，所以其突变率更高[5]。其发生突变会导致氧化磷酸化能力降低，从而影响卵母细胞的受精能力及胚胎的早期发育能力[8]。根据以往的研究发现，有一部分学者认为mtDNA量与胚胎移植的成功率有显著相关性，即高于一定的阈值时移植率降低，低于一定的阈值则移植率增加[17-18]。这与“quiet embryo”假说一致，quiet embryo提出代谢状态平稳的胚胎较代谢旺盛的胚胎存活力更高[19]。而另外一部分学者发现mtDNA量与胚胎发育质量之间并没有显著相关性[20-21]。造成实验结果差异的原因暂不明确，推测可能与种族、地域、环境及选取的实验标本和检测方法有关。

本研究为了探讨mtDNA量与胚胎质量与妊娠率之间的相关性，共收集了1 071个囊胚，采用NGS进行PGT和mtDNA量检测，发现mtDNA量与PGT结果有一定相关性：在胚胎PGT正常结果组中mtDNA量更低，而且移植PGT正常结果组胚胎其正常妊娠对应的平均线粒体DNA量更低，但由于移植数量较少，暂未发现统计学差异。

由于卵裂期胚胎细胞分裂时染色体分配的不稳定[22]，嵌合胚胎随之形成，因此卵裂期的活检往往会发生检测的卵裂球与实际剩下的胚胎染色体不一致的情况。因此囊胚期活检正在逐步取代卵裂期活检[23]。

而囊胚期的胚胎在很大程度上也都是嵌合型的胚胎，通过二代测序技术在植入前遗传学诊断领域的应用，发现用其检测外滋养层细胞会出现一定比例的嵌合结果，在这种情况下，如何判断胚胎内细胞团(未来的胎儿)的状态将是一个难题[24]。

研究推测存在一种胚胎自我修复机制，嵌合有二倍体细胞的胚胎，染色体正常和异常的细胞可能存在分裂效率和趋向的差异，非整倍体细胞最终被正常的二倍体细胞淘汰掉或者排除出内细胞团[25-26]。在这种情况下，我们通过检测外滋养层细胞的结果判断胚胎的好坏会使我们浪费掉宝贵的内细胞团正常胚胎。

我们在移植PGT嵌合结果组胚胎时发现，mtDNA量较低的胚胎可能更倾向于胎儿正常结果，其正常妊娠的几率更高。mtDNA可能给我们开启了一个窗口，线粒体反映的是整个胚胎的能耗状态，对于低能耗的嵌合体胚胎可能代表了其自我修复过程已趋于成功，内细胞团正常的机会要高于那些高能耗(mtDNA量较高)的胚胎。当然由于数据有限，要证明其相关性还需进一步扩大样本。

综上所述，mtDNA量的检测可能反映胚胎质量与妊娠结局，也可能反映嵌合胚胎的实际状态，未来或许可以作为胚胎选择的一项补充指标。但若要将这一指标应用于临床，则需要进一步加大样本量，并且建立一定的模型来充分验证。