柠檬酸处理对乳清分离蛋白凝胶特性的影响

陈琨，李桐，刘俐璐，李园园，姜瞻梅

（东北农业大学食品学院，乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨150030）

乳清蛋白（whey protein，WP）是乳清中多种蛋白质组分的统称，根据提取蛋白质的加工过程不同，可得到不同组成的乳清蛋白产品，如乳清浓缩蛋白（whey protein concentrate，WPC）是蛋白含量为34%～86%的商业产品，而经过进一步处理所得到的乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI），其蛋白质含量通常大于90%。乳清蛋白富含多种成分，包括β-乳球蛋白、乳铁蛋白、α-乳白蛋白、免疫球蛋白、血清白蛋白和乳过氧化物酶等，是一种营养丰富且易消化吸收的蛋白质[1-2]，有利于保持身体健康、提高免疫力、增强骨质和控制体重等，且乳清蛋白方便获取、价格低廉，适合用作食品基料，在制药、化学等其他许多领域都具有良好的应用价值[3]。

乳清分离蛋白具有多种功能特性，如溶解性、起泡性、凝胶性和乳化性等，因而适用于食品加工体系中。其中，凝胶特性是乳清蛋白的重要特性之一，它在许多食品的制备中都起着主要作用，如酸奶、果冻等，同时利用这种特性也可以将其作为增稠剂、微胶囊壁材等[4-6]。因此，不断探究各种因素对乳清分离蛋白凝胶性的影响，并提高乳清分离蛋白的凝胶特性从而扩大其在食品及其他领域的应用，具有重要的社会经济价值。近年来，随着科学技术的不断发展，国内外应用交联技术对乳清分离蛋白进行改性的研究日益增多，其方法主要包括酶交联[7]、化学交联[8]等。其中化学交联具有操作简便、反应快速等特点，因而在快速高效的基础上致力于开发安全的化学方法逐渐成为研究的热点。

柠檬酸（citric acid，CA），又名枸橼酸，因其具有愉悦的酸味，口感酸爽、安全无毒，被广泛用作酸味剂，特别是在食品和饮料中[9]。近年来，应用柠檬酸作为一种安全高效、价格低廉的交联剂，已经逐渐得到人们的关注。通过添加柠檬酸作为交联剂，促使乳清蛋白分子间产生一些新的酰胺键及二硫键，进而形成蛋白质交联。与此同时在疏水和范德华力的相互作用下，进一步促进了加热后凝胶结构的形成及凝胶特性的改善。孔令娟[10]探究将柠檬酸用于淀粉和小麦醇溶蛋白的交联，通过十二烷基硫酸钠盐-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）等方法证明，柠檬酸交联小麦醇溶蛋白的发生，也验证了柠檬酸交联可提高小麦醇溶蛋白的断裂强度；Bagheri 等[11]使用柠檬酸对乳清蛋白进行预交联处理，再通过乙醇脱溶剂产生蛋白颗粒，结果发现交联后形成的蛋白颗粒具有较好的消化稳定性。许多研究已表明柠檬酸可用于蛋白质的交联，并改善其部分功能特性，但是目前国内对柠檬酸处理改善乳清分离蛋白凝胶特性的研究还不全面。本研究以凝胶硬度和保水性为指标，探究柠檬酸处理对乳清蛋白的凝胶特性的影响，并在单因素试验基础上，应用响应面法进一步确定柠檬酸浓度及乳清分离蛋白浓度对其凝胶特性的交互作用，确定最优凝胶条件，致力于通过一种快速高效、安全无毒的化学方法改善乳清分离蛋白的凝胶特性，并为食品工业获得新型、安全、高效的乳清分离蛋白功能性基料提供基本理论数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白（蛋白质含量93.5%）：美国Mullins Whey Inc.公司；柠檬酸（≥99.5%）：上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TAXT-plus 质构分析仪：英国 SMS 公司；TGL20M高速冷冻离心机：百密思仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白交联样品的制备

将乳清分离蛋白（WPI）粉末溶解于去离子水中，在25 ℃下搅拌2 h，并在4 ℃下储存过夜以确保完全溶解。然后将其配制成蛋白质浓度为4%、6%、8%、10%、12%的溶液，即获得乳清蛋白溶液。向配制好的乳清蛋白溶液中添加柠檬酸，使其最终浓度分别为0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%，完全溶解后使用饱和氢氧化钠溶液调节混合液的pH 值至7.0，然后50 ℃条件下反应6 h；反应后将混合液冷却。

1.3.2 乳清蛋白凝胶特性的测定

将相同蛋白浓度、不含柠檬酸的WPI 溶液作为对照组；柠檬酸处理的WPI 溶液作为样品组。将对照组和样品组同时置于95 ℃水浴锅中恒温加热30 min，随后取出冷水浴冷却至25 ℃已形成凝胶。在4 ℃下放置24 h，备用。

用TAXT-plus 质构仪对凝胶硬度进行测量，采用P/0.5 探头。为避免破坏凝胶，测量时不要将凝胶从称量皿中移出。探头以2 mm/s 的速度穿刺，压缩比例为50%。将整个过程中的最大力定义为凝胶强度。数据对3 个平行样进行重复测定。

将凝胶均匀切成小块，取出一定量的凝胶进行称量，质量记作m，并置于50 mL 离心管中。记录离心前离心管总质量m1。以8 000 r/min 在4 ℃条件下离心30 min。离心后离心管中的水倒出再进行称量，离心管总质量记作m2。保水性按下式计算：

式中：m1为离心前凝胶和离心管总质量，g；m2为离心并排水后凝胶和离心管总质量，g；m 为凝胶质量，g。

1.3.3 单因素试验设计

研究乳清蛋白浓度（4%、6%、8%、10%、12%）和柠檬酸浓度（0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）对乳清蛋白凝胶特性的影响，将凝胶硬度和凝胶保水性作为观测指标。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以乳清蛋白浓度、柠檬酸浓度为自变量，凝胶强度和凝胶保水性分别为响应值，应用Design-Expert8.0 软件设计试验，如表1 所示，并进行二因素五水平的响应面法分析试验，然后通过分析得到最优凝胶条件。

表1 响应面试验因素及编码水平Table 1 Factors and coding levels of response surface experiment

1.4 统计分析

本研究均进行3 次独立重复试验，将所得结果取平均值并利用SPSS 22.0 软件对所有数据进行单因素方差分析，将P＜0.05 认为差异显著。利用Excel（2010）作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乳清蛋白浓度对凝胶硬度的影响

本研究选取在柠檬酸（CA）浓度为1%的条件下，探究不同乳清蛋白浓度对其处理后所形成凝胶硬度影响，其试验结果如图1 所示。

图1 乳清分离蛋白浓度对凝胶硬度的影响Fig.1 Effect of WPI concentration on gel hardness

由图1 可以看出，柠檬酸处理后的乳清蛋白其凝胶性显著提高，且乳清蛋白浓度对凝胶硬度也有显著影响（P＜0.05）。结果显示，在蛋白质浓度为4%、6%、8%时，未经处理的乳清蛋白经过加热处理未能形成凝胶；对比经过柠檬酸处理处理的乳清蛋白，其在各种浓度下均能形成凝胶，其凝胶硬度显著增大。同时，凝胶硬度随着蛋白质浓度的增加而显著增加，当乳清蛋白浓度为12%时，凝胶硬度最大，达到1 284.40 g。崔旭海等在探究环境条件对乳清蛋白凝胶特性的影响时也发现，在蛋白浓度为4%～14%的范围内随着乳清蛋白浓度的增高其凝胶硬度也随之增高[12]。分析其原因，推测是由于柠檬酸的加入使得乳清蛋白发生交联，蛋白质中的氨基和交联剂柠檬酸中的羧基发生亲核取代反应，氨基氮攻击具有部分正电荷的羰基碳进而形成新的酰胺键，柠檬酸的多个羧基参与反应使得蛋白质发生交联[13]，形成大分子聚合物，有助于形成更加致密的凝胶网络结构。而均匀致密的微观结构可能更易于与蛋白质凝胶中的水结合，有助于增强凝胶强度和保水性[14]，因此本研究中柠檬酸处理使得WPI 的凝胶硬度增加。同时，随着蛋白质浓度的增加，参与凝胶作用的蛋白质分子也随之增多，使得参与形成三维凝胶网络的蛋白质增多进而有助于凝胶硬度增大[15]。

2.1.2 乳清蛋白浓度对凝胶保水性的影响

本研究选取在柠檬酸（CA）浓度为1%的条件下，探究不同乳清蛋白浓度对其处理后所形成凝胶保水性的影响，其试验结果如图2 所示。

图2 乳清分离蛋白浓度对凝胶保水性的影响Fig.2 Effect of WPI concentration on water holding capacity of gel

由图2 可以看出，柠檬酸处理后的乳清蛋白其凝胶性显著提高，且乳清蛋白浓度对凝胶保水性也有显著影响（P＜0.05）。结果显示，在蛋白质浓度为4%、6%、8%时，未经处理的乳清蛋白经过加热处理未能形成凝胶；而经过柠檬酸处理的乳清蛋白，其在各种浓度下均能形成凝胶，对比可知其在蛋白质浓度为10 %和12%所形成凝胶的保水性均显著提高。同时，凝胶保水性随着蛋白质浓度的增加而显著增加，当乳清蛋白浓度为12%时，凝胶保水性最好，达到76.33%。蛋白凝胶的持水性取决于凝胶网络结合水的能力[16]。分析原因，由于柠檬酸的加入使得乳清蛋白发生交联并形成大分子聚合物，有助于形成更加致密的凝胶网络结构，同时，随着蛋白质浓度的增加，参与凝胶作用及形成三维凝胶网络的蛋白质增多，形成更均匀和更致密的凝胶网络，其具有更小的孔隙，其可以结合更大量的水并且有助于水分的截留，由此改善了凝胶的保水性[17]。

2.1.3 柠檬酸浓度对凝胶硬度的影响

本研究选取在WPI 浓度为10%的条件下，探究不同柠檬酸浓度对交联后乳清蛋白所形成凝胶硬度的影响，其试验结果如图3 所示。

图3 不同柠檬酸浓度下凝胶硬度的变化Fig.3 Effect of CA concentration on gel hardness

由图3 可以看出，乳清蛋白凝胶硬度随着柠檬酸浓度的增加而先上升后下降，且柠檬酸浓度对凝胶硬度影响效果显著（P＜0.05），在柠檬酸浓度为0.6%时，凝胶硬度达到最大，为1 059.36 g。

柠檬酸浓度较小时，凝胶硬度随着柠檬酸浓度的增加而增加，分析其原因是柠檬酸交联乳清蛋白形成大分子聚合物，参与形成凝胶网络的大分子物质有助于形成致密的凝胶结构进而增加凝胶硬度。随着柠檬酸浓度的增加，使得样品溶液中的离子强度不断升高，柠檬酸在交联蛋白质的同时，也通过静电屏蔽作用使蛋白质分子聚集，使之形成三维网络结构[18]，而在参与交联的乳清蛋白数量有限的情况下，过多柠檬酸的加入可能使得静电排斥力增加，因此使得所形成凝胶的强度有所下降。

2.1.4 柠檬酸浓度对凝胶保水性的影响

本研究选取在WPI 浓度为10%的条件下，探究不同柠檬酸浓度对处理后乳清蛋白所形成凝胶保水性的影响，其试验结果如图4 所示。

图4 不同柠檬酸浓度下凝胶保水性的变化Fig.4 Effect of CA concentration on water holding capacity of gel

由图4 可以看出，柠檬酸处理的乳清蛋白其凝胶保水性显著提高（P＜0.05），但随着柠檬酸浓度的升高其凝胶保水性下降。在柠檬酸浓度为0.3%时，凝胶保水性最好，达到97.23%。这可能由于柠檬酸处理乳清蛋白形成大分子聚合物，参与形成凝胶网络的大分子物质有助于形成更加致密的凝胶结构，同时，由于细密的凝胶网络的微小孔隙和可用于与水相互作用的更多位点，凝胶保水性得到改善，这些位点是包含在WPI-CA 产物中的柠檬酸残基的游离羟基[19]。但是随着柠檬酸浓度的增加，可能在蛋白质之间建立了较多共价键降低了蛋白质链的柔韧性并且具有更少的链间空间[20]，同时样品溶液中的离子强度不断升高，凝胶相互结合不紧密，导致结合水的能力下降[21]。

2.2 响应面法优化凝胶工艺条件

2.2.1 响应面法试验设计及结果

在单因素试验基础上，以乳清蛋白浓度、柠檬酸浓度两个因素为响应因素，以凝胶硬度和保水性为响应值，响应面试验设计及结果（取平均值）如表2 所示。

表2 中心复合试验设计及结果Table 2 Central composite test design and results

2.2.2 回归模型的建立与分析

采用Design Expert 8.0 软件对表2 中的数据进行多元回归拟合分析和显著性检验，建立的凝胶硬度、保水性与各因素变量的二次方程模型为：

凝胶硬度：Y1=601.17A-24.80B-226.77AB-39.31A2-228.05B2+1 261.76

保水性：Y2=-0.033A-0.10B+0.014A2+0.009 5B2+0.046AB2+0.75

凝胶硬度回归模型方程的方差分析如表3 所示。

表3 凝胶硬度回归模型方程的方差分析Table 3 Variance analysis of gel hardness regression model equations

由表3 的凝胶硬度回归模型方程的方差分析可知，方程因变量与自变量之间的线性关系明显。回归方程模型的F 值为173.28，P 值小于0.01，这表明此回归方程模型极显著。失拟项P 值为0.245 3 大于0.05，表明失拟项不显著。该模型R2=0.992 0，R2adj=0.986 3，说明模型与试验拟合度较高，响应值与响应因素线性关系显著。

凝胶保水性回归模型方程的方差分析如表4 所示。

表4 凝胶保水性回归模型方程的方差分析Table 4 Variance analysis of gel water holding capacity regression model equations

由表4 的凝胶保水性回归模型方程的方差分析可知，因变量与自变量之间的线性关系明显。回归方程模型的F 值为28.41，P 值小于0.01，这表明此回归方程模型极显著。该模型R2=0.953 0，R2adj=0.919 5，说明模型与试验拟合度较高，响应值与响应因素线性关系显著。

2.2.3 响应面分析

两因素对凝胶硬度影响的响应面图见图5。

图5 蛋白质浓度与柠檬酸浓度对乳清蛋白凝胶硬度的影响Fig.5 Effect of protein concentration and citric acid concentration on the hardness of WPI gel

如图5 所示，在较低的柠檬酸浓度范围内，随着蛋白质浓度的升高，凝胶强度呈逐渐升高的趋势；但是在较高的柠檬酸浓度下，随着WPI 浓度的增加呈先上升后下降的趋势。在WPI 浓度为12%时，随着柠檬酸浓度逐渐增加，WPI 凝胶硬度有逐渐降低的趋势。在柠檬酸浓度较低时，蛋白质浓度较高时具有最高的凝胶保水性，两因素具有显著的相互作用，乳清蛋白对处理后凝胶硬度的影响更大。

两因素对凝胶保水性影响的响应面图见图6。

图6 蛋白质浓度与柠檬酸浓度对乳清蛋白凝胶保水性的影响Fig.6 Effect of protein concentration and citric acid concentration on the water holding capacity of WPI gel

如图6 所示，随着蛋白质浓度的增加，WPI 的凝胶保水性呈上升趋势；随着柠檬酸浓度的增加，WPI 的凝胶保水性呈下降趋势，且下降速率减缓。乳清蛋白浓度与柠檬酸浓度具有共同作用，乳清蛋白的作用更加有效，在柠檬酸浓度较低时，蛋白质浓度较高时具有最高的凝胶保水性。

2.2.4 回归模型的验证与对照试验

利用软件寻优，得到的具有最佳凝胶特性的工艺条件为蛋白质浓度为12%、柠檬酸浓度为0.3%，将混合溶液在50 ℃条件下水浴6 h。在此条件下由响应面模型预测的WPI 的凝胶硬度和保水性分别为1 847.14 g、89.021 9%。为检验回归模型的可靠性，采用优化得出的工艺条件进行3 次验证试验，结果得到的WPI 的凝胶硬度为1 813.82 g，保水性为88.56%。与模型预测值非常接近，表明此模型有效，验证了响应面模型的正确性。对比不加入柠檬酸、蛋白质浓度为12%，其他条件相同的情况下，得到的WPI 的凝胶硬度为15.7 g，保水性为37.68%，可知此柠檬酸处理方法对WPI 的凝胶特性有较大提高。

3 结论

本研究尝试使用柠檬酸处理提高乳清蛋白的凝胶特性，通过单因素试验和两因素五水平的中心复合响应面试验设计探究柠檬酸浓度和乳清蛋白浓度对其凝胶特性的影响，并预测出最佳优化条件。通过验证试验后，结果表明具有最佳凝胶特性的柠檬酸处理乳清蛋白条件为蛋白质浓度为12%，柠檬酸浓度为0.3%；在该条件下，制得的凝胶硬度为1 813.82 g，保水性为88.56%，与模型预测值1 847.14 g、89.021 9%相近。同时，对比未处理乳清蛋白，最优条件下的柠檬酸处理可以显著改善其凝胶特性。