RRBP1与RABEX-5蛋白在结直肠癌组织中的表达及与临床病理特征和预后的关系

廖代祥 郑 博 张彦斌 于军辉

结直肠癌是临床中常见的恶性肿瘤，近年来随着我国生活水平的不断提高，结直肠癌发病率与死亡率不断增加，严重威胁我国居民健康和生活质量[1]。相关研究表示，一些肿瘤分子与结直肠癌的发生发展存在密切的关系。因此，为了能够对患者进行早期诊断与治疗，从而降低死亡率，寻找有效的生物标志物是目前临床研究的重点。核糖体结合蛋白1(RRBP1)是一种核糖体结合以及新生蛋白跨膜移位必不可少的粗面内质网蛋白[2]，既往研究发现，RRBP1表达与子宫内膜癌、食管癌等肿瘤的发展有关[2-3]。RABEX-5是目前新发现的一种鸟苷酸交换因子，能够与RABAPTIN-5形成复合物从而激活RAB5[4]，并有研究表明，RABEX-5在胃癌组织中表达水平高于正常组织[5]。但目前关于RRBP1、RABEX-5在结直肠癌组织中表达水平的研究结果较少。因此，本研究主要探讨RRBP1与RABEX-5蛋白在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

将2015年8月—2016年8月进行外科手术治疗的86例结直肠癌患者作为本研究对象，在术后收集患者的癌组织标本以及相对应的86例癌旁组织标本(距癌组织5 cm)。其中男性46例，女性40例；年龄23～80岁，平均年龄(63.69±6.47)岁。肿瘤分期参照美国癌症联合委员会/国际抗癌联盟分期系统第7版中的标准[6]。纳入标准：(1)所有研究对象均经病理检查确诊为结直肠癌，并符合结直肠癌诊断标准[7]；(2)获得患者及家属的知情同意，并签署知情同意书；(3)术前未进行放化疗等相关治疗者；(4)临床资料完整者。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)严重肝肾功能不全、心脑血管疾病者；(3)代谢异常者；(4)既往精神病史者。本次研究已获得医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 试剂 兔抗人RRBP1单克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗人RABEX-5多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；免疫组化试剂盒、柠檬酸盐、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 免疫组化染色法 采用免疫组织化学检测RRBP1、RABEX-5蛋白表达水平。按照说明书将RRBP1抗体按照1∶500稀释，RABEX-5抗体按照1∶1 000稀释。所有标本均进行常规固定、包埋、切片；并在脱蜡后使用3%过氧化氢处理30 min阻断内源性过氧化物酶，随后进行柠檬酸盐抗原修复，加入一抗，4℃孵育过夜。再加二抗孵育，使用DAB盒显色，苏木素复染，氨水返蓝后冲洗，脱水、透明以及封片，最后用PBS代替一抗作为空白组对照，一切操作均严格按照SP试剂盒说明书进行。

1.2.3 结果判定[8]随机选取5个高倍镜视野计数，RRBP1和RABEX-5蛋白均定位于细胞质中，其染色阳性表达为棕黄色或棕褐色颗粒。根据细胞染色强度与阳性细胞百分比进行综合评分：(1)根据阳性细胞染色强度：无色为0分，淡黄色为1分，棕色为2分，棕褐色为3分；(2)根据阳性细胞百分比进行评分：<5%为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分；(3)将阳性细胞比例与着色强度相乘结果为：≥6分为阳性表达，<6分为阴性表达。免疫结果由两位高年资深的病理医师共同完成。

1.3 随访

采用电话或者门诊进行随访，随访截止时间为2019年8月30日，随访时间为2～48个月，以死亡为终点。总生存期为出院开始至出现终点结局事件或截止时间点的时间范围。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0软件进行数据统计学分析，计数资料以率(%)表示，采用四格表资料χ2检验或配对χ2检验比较；采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验比较不同临床特征结直肠癌患者的生存情况，通过单因素和多因素Cox比例风险回归模型分析影响结直肠癌患者预后的相关因素，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 癌组织和癌旁组织RRBP1、RABEX-5蛋白表达情况的比较

结肠癌癌组织RRBP1、RABEX-5蛋白阳性表达率分别为65.12%和62.79%；结肠癌癌旁组织RRBP1、RABEX-5蛋白阳性表达率分别为38.37%和36.05%，两组RRBP1、RABEX-5蛋白阳性表达率比较有统计学差异(P<0.001)(表1，图1，图2)。

表1 RRBP1、RABEX-5蛋白表达情况的比较Table 1 Comparison of RRBP1 and RABEX-5 protein expression in colorectal cancer and paracancerous tissues

2.2 RRBP1、RABEX-5蛋白表达阳性与结直肠癌临床病理特征的关系

RRBP1、RABEX-5表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小无关(P>0.05)，与结直肠癌的TNM分期、分化程度、淋巴结有关(P<0.01)，TNM Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤低分化、出现淋巴转移的患者的RRBP1和RABEX-5阳性表达率均升高(P<0.05)(表2)。

表2 RRBP1、RABEX-5蛋白表达阳性与结直肠癌临床病理特征的关系Table 2 The relationship between the positive expression of RRBP1 and RABEX-5 proteins and clinicopathological features of colorectal cancer patients

2.3 RRBP1、RABEX-5蛋白与结直肠癌预后的关系

86例结直肠癌患者随访时间范围为2～48个月。结直肠癌患者中位总生存期27个月(95%CI：25～29个月)，其中RRBP1阳性表达和阴性表达的中位总生存期分别为20个月(95%CI：17～23个月)和30个月(95%CI：28～32个月)，RABEX-5阳性表达和阴性表达中位总生存期分别为19个月(95%CI：16～22个月)和31个月(95%CI：29～23个月)，差异有统计学意义(χ2=15.632，17.869，P<0.001)(图3，图4)。

2.4 影响结直肠癌患者预后的单因素分析

经单因素分析得出，TNM Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤低分化、出现淋巴转移、RRBP1、RABEX-5阳性表达的结直肠癌患者总生存期均显著缩短(P<0.05)(表3)。

表3 影响结直肠癌患者预后的单因素分析Table 3 Univariate analysis of prognostic factors in patients with colorectal cancer

图1 RRBP1蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况Figure 1 The expression of RRBP1 protein in colorectal cancer and adjacent tissuesNote：A.The positive expression of RRBP1 in colorectal cancer tissues；B.The negative expression of RRBP1 in adjacent tissues.

图2 RABEX-5蛋白在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达情况Figure 2 The expression of RABEX-5 protein in colorectal cancer and adjacent tissuesNote：A.The positive expression of RABEX-5 in colorectal cancer tissues；B.negative expression of RABEX-5 in adjacent tissues.

图3 RRBP1蛋白表达阳性与阴性结直肠癌患者的生存曲线比较Figure 3 Comparison of survival curve between positive and negative RRBP1 expression in colorectal cancer patients

图4 RABEX-5蛋白表达阳性与阴性结直肠癌患者的生存曲线比较Figure 4 Comparison of survival curve between positive and negative RABEX-5 expression in colorectal cancer patients

2.5 影响结直肠癌预后的多因素Cox回归分析

经多因素Cox比例风险回归模型分析得出，TNM Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤低分化、淋巴转移、RRBP1、RABEX-5阳性表达均为影响结直肠癌患者预后的独立因素(P<0.01)(表4)。

表4 影响结直肠癌预后的多因素Cox回归分析Table 4 Multivariate Cox regression analysis for prognosis of colorectal cancer patients

3 讨论

结直肠癌发病率居我国所有癌症的第四位，男性发病率高于女性，一般早期症状不明显，仅仅出现消化不良或便血，但当患者出现全身症状时已处于中晚期[9]。虽然随着我国医疗的不断发展，在结直肠癌治疗方面有了重要突破，但后期生存率仍然较低，且有1/5患者在疾病确诊时已发生远处转移[10]。同时有相关数据显示，我国结直肠癌的发病率、死亡率每年增长3.33%、3.05%[11]。而近几年以来发现有效生物标志物能够在肿瘤诊断中发挥重要效果。因此，本研究主要分析RRBP1与RABEX-5蛋白在结直肠癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。

RRBP1主要由1 410个氨基酸组成，主要定位于内质网，能够在分泌组织中发挥重要效果[12]。有研究表明，RRBP1在肺癌组织中表达水平升高，与癌组织的发生发展有关[13]。RABEX-5与RABAP-5形成可溶复合物，包含492个氨基酸残基，由5个结构域组成，主要定位于细胞质内，能够发挥激活RAB5的功能，同时能够参与调节细胞吞噬过程中的囊泡融合等效果，并且当RABEX-5表达异常时能够导致细胞吞噬功能障碍，从而导致疾病的出现以及恶化[14-15]。同时有研究发现，RABEX-5与RAB5能够共同参与肿瘤的发生发展[16]。

本研究结果显示，癌组织RRBP1、RABEX-5蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织，且结直肠癌患者为TNM Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤低分化、出现淋巴转移时，RRBP1、RABEX-5阳性表达率均升高，表示RRBP1、RABEX-5表达水平升高能够反应结直肠癌的严重程度。有研究显示[17]，RRBP1在甲状腺肿瘤组织中表达水平升高，且表达水平与临床病理特征相关。同时有研究显示，RABEX-5在有些癌症细胞中呈高表达[18]。本研究随访结果显示，RRBP1阳性表达和阴性表达的患者中位总生存期分别为20个月、30个月，RABEX-5阳性表达和阴性表达的患者中位总生存期分别为19个月、31个月，表示RRBP1、RABEX-5表达水平与患者的预后存在密切关系。为进一步了解影响患者预后的因素，本研究经单因素与多因素分析结果显示，TNM Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤低分化、淋巴结转移、RRBP1、RABEX-5阳性表达均为影响结直肠癌患者预后的独立因素，表示结直肠癌组织恶性程度升高时，RRBP1、RABEX-5表达水平升高，且表达水平与肿瘤的发生、发展以及预后均密切相关，能够作为预测肿瘤严重程度以及预后生存的有效指标。

综上所述，RRBP1蛋白与RABEX-5蛋白在结直肠癌组织中的表达水平均升高，且与结直肠癌患者的临床病理特征有关，RRBP1蛋白阳性表达与RABEX-5蛋白阳性表达均是结直肠癌预后的危险因素，二者可作为结直肠癌诊断和预后的有效生物标志物。但本研究选取样本量较少且研究时间过短，仍需进一步深入研究。