干血斑耳聋基因检测在茂名地区新生儿遗传性耳聋诊断中的应用

李富，宁学玲，陈海玲

1.茂名市妇幼保健院新筛中心，广东 茂名 525000；

2.湛江市中心人民医院检验科，广东 湛江 524037

遗传性耳聋是临床常见的先天性耳聋，与遗传性耳聋相关的基因突变位点较多，临床常用酶切法和直接测序法较难同时检测多个基因突变位点。基因芯片技术高效、快速、方便，是高通量基因检测方法，适合大规模人群进行遗传性耳聋基因筛查[1]。我国汉族人群耳聋患者最常见的基因突变是缝隙连接蛋白β2基因(GJB2)、离子转运体26A4蛋白基因(SLC26A4)、GJB3、线粒体mtDNA 12s rRNA等[2]，但是不同地区耳聋基因突变具有显著差异性。为了解茂名地区耳聋相关基因突变特点，本研究采用干血斑基因检测技术对170例遗传性耳聋患者进行检测，现将结果报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年5月至2019年3月茂名地区医院优生优育遗传医学中心门诊筛查的5 542例汉族儿童为研究对象，其中210例复查，共170例遗传性耳聋患儿纳入研究，排除伴智力障碍、颅脑占位性病变、综合征聋、外耳与中耳畸形患儿。所有患儿家长均签署知情同意书。170例遗传性耳聋患儿中男性104例，女性66例；年龄2~8岁，平均(4.56±2.05)岁；听力损失程度：轻度听力损失(26~40 dBHL)40例，中度听力损失(41~60 dBHL)45例，重度听力损失(61~80 dBHL)47例、极重度听力损失(>80 dBHL)38例。另选择筛查健康的汉族儿童60为对照组，男性37例，女性23例；年龄2~7岁，平均(4.49±2.16)岁，听力均正常。两组受试者年龄、性别分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 干血斑DNA提取 采集受试者末梢静脉血，移液器取自然下落血滴(约50μL)于Whatman903滤纸，血斑直径8 mm，保证滤纸两面充分渗透，室温下自然干燥，每单张试纸放入自封袋内，室温干燥保存待检。采用离心柱型血液DNA提取试剂盒(潮州凯普)提取干血斑DNA，打孔器打取直径3 mm干血斑3片，每份加200μL(缓冲液)和20μL蛋白酶K，震荡混匀，56℃温浴20 min，加入200μL无水乙醇混匀转入带硅胶离心柱，10 000 r/min离心1 min然后，利用洗液W1洗脱1次，洗液W2洗脱2次，利用TE洗脱液获取DNA液60μL，将Taq酶分别加入到A组和B组PCR mix中配置总反应体系，混匀，点动离心，按照A组(28μL)和B组(28μL)的体系分别分装到0.2 mL PCR管中，将临床DNA按顺序加入到A组和B组体系中。A组：2μL，B组：2μL，标记各管，混匀，离心，各管对应放入PCR仪中，注意各管盖盖紧，注意检查扩增程序是否正确，启动程序。DNA样品-20℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 PCR反应体系为25μL，含有60 ng DNA，2.5μL dNTPs(2 mmol/L)，PCR扩增反应条件：37℃预变性10 min，95℃变性9 min，96℃1 min，94℃30 s，RAMP 0.4℃/s，55℃30 s，共35个循环，RAMP0.2℃/s，70℃45 s，60℃延伸6 min。PCR扩增试剂等均购自成都博奥生物有限公司。PCRmix放置4℃解冻；临床样本DNA解冻，将Taq酶分别加入到A组和B组PCRmix中配置总反应，按照A组(28μL)和B组(28μL)的体系分别分装到0.2 mL PCR管中，将临床DNA按顺序加入到A组和B组体系中，标记各管，混匀，离心，各管对应放入PCR仪中，注意各管盖盖紧，注意检查扩增程序是否正确，启动程序。

1.2.3 杂交、洗片、读片 PCR产物(A组和B组)放PCR仪中进行95℃变性7 min，按要求放置配件，铺好杂交膜，加入杂交液0.8 mL，预杂交45℃2 min以上，开泵，排杂交液，关泵，加入杂交液0.8 mL，将A组和B组PCR产物按一定顺序加入到相应反应槽，注意每加一个立即混匀，杂交45℃，20 min，WB1液0.8 mL清洗4次，每次冲洗间隔5~10 s。洗完WB1液后再把杂交仪温度调节为25℃，加入0.5 mL封阻液，预封阻，当温度降至30℃时，开泵排液，关泵，加封阻液0.5 mL，封阻5 min，开泵排液，加酶标液0.5 mL，放置5 min，开泵排液，溶液A 0.8 mL清洗四次，清洗第二次时将温度设定36℃，当杂交仪温度达到36℃时加显色液0.5 mL，盖好杂交仪盖，显色6 min，加杂交液0.8 mL，清洗三次，最后加蒸馏水清洗。最后按照凯普公司提供的标准判读卡判读结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS25.0软件进行数据分析，一般人口统计学资料采用统计学描述，年龄、性别分布分别采用独立样本t检验和χ2检验。耳聋相关基因采用(%)表示，遗传性耳聋患者与健康对照组耳聋基因突变率比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耳聋基因检测结果 经复查210例受检者中有188例遗传性耳聋患儿，其中170例携带相关基因突变，突变率为90.43%，而健康对照组未检测到相关基因突变，两组基因突变率比较差异有显著统计学意义(χ2=170.504，P<0.01)。

2.2 170例遗传性耳聋患儿耳聋基因检测结果 170例携带相关基因突变患儿中GJB2基因突变检出率最高，达47.65%(81/170)，以235delC突变为主，占基因突变患儿的40.00%，其次为299delAT、176del16。SLC26A4基因突变率为37.06%(63/170)，以IVS7-2A>G突变为主，占基因突变患儿32.94%，其次为2168A>G突变，占基因突变患儿的4.12%。mtDNA 12s rRNA突变率最低，为11.18%(19/170)，以1555A>G突变为主，占基因突变患儿的4.71%。本组共检出特殊类型突变携带者7例，包括155.7445.1229.12201突变，见表1。

表1 170例遗传性耳聋患儿耳聋基因检测结果

3 讨论

我国1/3残疾人口为听力缺失，病例数达2 780万人，每年约3万名听障儿童出生，其中遗传性耳聋占50.00%，据统计新生儿中耳聋发病率为1‰，约50.00%与遗传因素相关[3]。小儿遗传性耳聋多在2岁以后发现语言能力障碍后确诊，使患者丧失最佳医学干预时机，造成无法补救的听力和语言功能损伤。因此早期发现，早期通过耳聋基因筛查确诊，可最大程度避免因聋致哑，保证患儿参与基本社会生活的能力。基因检测要求较高的实验室设备和专业技术人才，在基层医院尚未普及，大量基层单位多采取将标本转诊至省级医疗单位或独立的检验机构进行检测，采血管转运存在低温转运不便、容易破损等问题，影响检测结果准确性。干血斑将采集适量血标本滴在滤纸片上干燥而成，仅需采集少量标本，常温下可稳妥保存且便于运输等，适合基层医院基因检测血液标本的采集和转运，广泛应用于遗传性耳聋的筛查。

GJB2、GJB3和SLC26A4、DNA 12SrRN等是目前与遗传性耳聋基因研究的热点，被多数国内外研究证实与耳聋的发生有关。GJB2是最常见的耳聋遗传基因，我国语前耳聋患者中GJB2突变率为26.00%~33.00%。GJB2基因突变可引起缝隙连接蛋白Cx26功能改变，导致钾离子进入内耳淋巴液，造成Croti螺旋器钾中毒，淋巴液循环障碍，发生听力障碍。我国不同地区耳聋患者GJB2突变率为4.00%~30.40%[4]。本研究显示170例携带相关基因突变患儿中GJB2基因突变检出率最高，达47.65%(81/170)，提示遗传性耳聋患儿GJB2基因突变率最高，与多数研究报道一致。235delC是亚洲人群GJB2基因突变最常见的位点，该位点突变导致隙连连接蛋Cx26截断，影响缝隙连接，导致感音神经性耳聋[5]。本研究检测235delC基因突变率最高，达40.00%，高于176del16、299delT，提示235delC突变可能导致茂名地区遗传性耳聋的主要耳聋基因。徐彬等[6]检测了安徽地区汉族遗传性耳聋儿童GJB2基因突变特点，发现235delC基因突变率最高。本研究未检测到35delC基因突变，35delC突变在我国西北回族和维吾尔族耳聋患儿中发生率较高[7]，本研究以汉族人群为主，因此较为少见，提示GJB2基因突变位点存在较大地区和民族差异。

SLC26A4是语前耳聋患者基因突变率仅次于GJB2突变基因，SLC26A4基因突变具有明显种族差 异 性，T416P、L236P、2168A>G、IVS7-2A>G是SLC26A4基因常见突变类型，其中欧洲人SLC26A4基因突变类型以T416P和L236P为主，日本和韩国人以2168A>G为主，中国台湾以IVS7-2A>G突变常见。IVS7-2A>G基因突变可使第8号外显子功能障碍，影响氯离子转运，引起大前庭导水管综合征，导致感音神经性聋，但是具体机制尚不清楚。中国汉人SLC26A4基因突变类型IVS7-2A>G和2168A>G检出率最高分别达44.11%和11.60%[8]。本研究观察茂名地区遗传性耳聋患儿SLC26A4基因突变率37.06%(63/170)，仅次于GJB2，IVS7-2A>G纯合突变率最高，本组携带SLC26A4基因突变患儿中例出现大前庭导水管综合征，与临床诊断符合，提示检测SLC26A4基因有助于遗传性耳聋的诊断。

线粒体DNA 12srRNA基因是与氨基糖苷类药物性耳聋及非综合征耳聋有关的母系遗传基因，1555A>G、1494C>T是mtDNA 12s rRNA较为常见的突变位点。国内报道1555A>G突变阳性率为1.00%~3.00%[9]，本研究中1555A>G是mtDNA 12s rRNA检出率最高的突变基因位点，但其突变检出率较低，仅4.71%，低于我国西北地区经济条件相对落后地区[10]。分析原因可能是近年来临床对儿童用药安全性意识提高，规范氨基糖苷类药物的应用，严格限制儿童使用氨基糖苷类药物，避免其接触此类耳毒性药物大大减少了耳聋发生率。1494C>T突变检出率0.59%，提示1494C>T不是茂名地区遗传性耳聋的热点突变。GJB3也是遗传性耳聋相关基因，其突变可导致缝隙连接蛋白Cx31功能丧失，导致内淋巴液钾离子循环障碍，影响内耳毛细胞功能而致聋。本研究未检测到GJB3基因突变，詹悦等[11]检测了湖北地区306例极重度耳聋患儿耳聋相关基因变异情况，也未发现GJB3基因突变，提示GJB3也不是茂名地区遗传性耳聋的热点突变。

综上所述，本研究通过茂名地区170例遗传性耳聋患儿采用干血斑基因检测技术检测耳聋相关基因发现GJB2、SLC26A4、mtDNA 12s rRNA基因突变可能是茂名地区遗传性耳聋患儿主要致聋基因，235delC、IVS7-2A>G、1555A>G是本组遗传性耳聋最常见的基因突变类型。由于本研究纳入样本例数较少，因此茂名地区遗传性耳聋儿童耳聋基因突变特点仍需继续扩大样本加以证实。