HLA-DQB0502HLA-A0303位点多态性与IVF-ET患者妊娠率的相关性

刘浏，张若鹏，王惠莹，罗加欢，周宁，张媛媛

1.大理大学临床医学院，云南 大理 671000；

2.大理大学第一附属医院生殖医学科，云南 大理 671000；

3.大理大学生殖医学研究所，云南 大理 671000

随着现代社会压力与日剧增和环境污染的加重，一定程度上影响了人类的身体健康，且伴随着国家二胎政策的开放，准备生育二胎的家庭增多，而高龄产妇生育力存在着一定程度的下降，导致不孕症发病率逐年上升，目前该病已成为严重影响我国居民生活质量的第三大疾病[1]。而针对不孕症主要是病因治疗，在治疗不理想的情况下，则行辅助生殖技术(assisted repruductive technology，ART)，以体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)应用较为广泛，但其影响因素众多[2-3]，常常难以获得令人满意的结果。而目前针对IVF-ET患者妊娠率与SNP位点多态性的相关性研究并不十分明确，因此，本研究探讨SNP位点与IVF-ET患者妊娠率的关联，以期能够为IVF-ET患者早期诊断及相关干预提供一定的依据，从而服务于临床，造福于广大不孕不育患者。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取于2017年12月至2018年5月在大理大学第一附属医院生殖医学科行IVF-ET且符合以下纳入和排除标准的不孕症患者330例，根据术后是否妊娠分为妊娠组120例和未妊娠组210例。纳入标准：①年龄25~35周岁；②无吸烟史；③无双侧卵巢手术史；④卵巢功能正常；⑤宫腔正常；⑥双方染色体检查正常；⑦无传染性疾病。排除标准：①卵巢功能异常；②内分泌异常；③解剖异常；④男性精液异常；⑤生殖道感染。妊娠组平均年龄(31.30±3.58)岁，未妊娠组平均年龄(31.28±3.43)岁，两组患者年龄比较差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因位点多态性检测 采集两组患者EDTA-K2抗凝血标本4 mL，若未及时检测，将标本冻存于-20℃冰箱中待检。检测时，将标本从冰箱取出，冰上解冻。采用Maglso Swab DNA Isolation Kit试剂盒、oKtopure自动化核酸提取仪对样本核酸进行提取，所有操作严格按照说明书进行。根据基因上的SNP位点序列的分析结果设计特异性引物，然后采用竞争性等位基因特异性PCR(KASP)法对所选基因进行检测。每孔PCR反应体系为2×KASPV4.0 MasterMix 0.8μL、72×KASPassaymix 0.022μL、DNA template 0.8μL，根据要检测的样本数和检测的SNP位点，配置相应的MasterMix和assaymix混匀，转到96孔板中，运用LGC的IntelliQube仪器，将混合Mix和DNA模板依次加入384孔的PCR板小孔中，将PCR板进行密封。启动仪器进行PCR扩增反应。最后通过IntelliQube仪器对PCR扩增产物进行荧光扫描，读取荧光信号，通过散点图获得基因分型结果。

1.2.2 IVF-ET方法及妊娠判定 采用标准长方案进行控制性超促排卵，卵泡成熟时，在超声引导下行卵泡穿刺取卵，在取卵当日，采用二层密度梯度离心法处理男方所取精液，行体外受精，18 h后将正常受精卵继续进行体外培养，第三天行胚胎移植，所剩胚胎依情况冻存或是继续囊胚培养，移植后继续予以黄体酮支持疗法。子宫内膜分型如下：A型内膜：常见于内膜增生早期，典型三线型或多层子宫内膜，外层和中央为强回声线，外层与宫腔中线之间为低回声区或暗区，内膜厚度为4~9 mm。B型内膜：常见于内膜增生晚期，均一的中等强度回声型，宫腔强回声中线断续不清，内膜厚度9~12 mm。C型内膜：常见于黄体期，均质强回声，无宫腔中线回声，厚度10~14 mm。移植后第14天采血测血清HCG>5 U/L，或晨尿尿HCG检测为阳性，诊断为生化妊娠，继续采用黄体支持疗法，6周后，超声检测到胎心活动或者孕囊为妊娠成功，未检测到胎心活动或者孕囊为妊娠失败，即未妊娠。

1.3 统计学方法 应用SPSS21.0软件对所有数据进行分析，对所选基因进行Hardy-Weinbrg平衡检验，以保证所选样本的随机性，等位基因频率计算：基因频率=每组某等位基因数/该组两等位基因数之和，计量资料以均数±标准差±s))表示，两两比较采用t检验，计数资料行χ2检验，并对各基因型行风险分析，计算其优势比(odds ratio，OR)，衡量研究因素与IVF-ET患者妊娠率的关联强度，当OR>1时，所研究基因型为妊娠成功的保护因素，当OR<1时，所研究基因型为妊娠成功的危险因素，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者的移植胚胎类型和移植胚胎数比较 两组患者的移植胚胎类型和移植胚胎数比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者的移植胚胎类型和移植胚胎数量比较(例)

2.2 两组患者的子宫内膜分型和子宫内膜厚度比较 妊娠组A、B、C型子宫内膜分别为36例、48例、36例，未妊娠组子宫内膜分型分别为62例、85例、63例，两组子宫内膜分型比较差异无统计学意义(χ2=0.01，P=0.99)；妊娠组子宫内膜厚度为(11.00±1.91)mm，未妊娠组为(10.49±2.09)mm，差异无统计学意义(t=0.98，P=0.33)。

2.3 两组患者各基因型的表达率比较 在本次检测的4个SNP位点当中，经Hardy-Weinbrg平衡检验，rs6906021不符合遗传平衡(χ2=8.58，P=0.01)。rs2300825(χ2=3.69，P=0.16)、rs2524005(χ2=4.66，P=0.10)、rs2855591(χ2=4.84，P=0.09)均符合遗传平衡。rs2524005(C/T)、rs2855591(C/T)各基因型表达率在两组患者中差异无统计学意义(P>0.05)。rs2300825(A/G)各基因型表达率差异具有统计学意义(P<0.05)。妊娠组rs2300825多态性位点A等位基因频率为87.1%，未妊娠组为80.0%，妊娠组显著高于未妊娠组，差异具有统计学意义(P<0.05)，且经OR值分析发现rs2300825(A/G)、rs2300825(A/A)相比于rs2300825(G/G)可提高IVF-ET患者的临床妊娠率，OR值分别为1.526、2.769，见表2~表4，部分基因位点分型散点图见图1。

表2 两组患者各基因型的表达情况比较(例)

表3 rs2300825(A/G)等位基因频率比较[例(%)]

表4 rs2300825位点各基因型OR值分析(例)

图1 部分样本基因分型散点图

3 讨论

分别对符合WHO诊断标准的两组不孕症患者行IVF-ET[4]，两组患者的年龄、移植胚胎类型、移植胚胎数、子宫内膜分型、子宫内膜厚度相比差异不具有统计学意义，具有可比性，且以上因素对临床妊娠率没有影响。

随着近年来不孕不育发病率逐渐升高，IVF-ET应用逐步普及，但目前我国行体外受精-胚胎移植首次的成功率仅有30%左右[5]，且即使妊娠成功，也有众多因素影响患者成功诞下胎儿[6]。HLA与人体免疫功能、免疫状态及自身免疫易感性密切相关[7-8]，人体受孕本就是一个免疫过程，胚胎相对于母体是一种半同体抗原，研究表明多种不良妊娠情况都与HLA多态性相关[9-10]。HLA是人类主要组织相容性复合体的产物，位于第6号染色体短臂上，HLA分为HLA-I和HLA-II，其中，Ⅰ类由HLA-A、B、C位点编码，Ⅱ类抗原受控于HLA-D区(包含5个亚区：DP,DM,DO,DQ和DR)。本次研究中所筛选的4个SNP位点中，rs2524005、rs2855591位于HLA-A*0303区，rs6906021、rs2300825位于HLA-DQB*0502区。其中，rs2300825、rs2524005、rs2855591符合Hardy-Weinbrg平衡，表明本次研究所纳入的群体具有较强的代表性。两组患者中，rs2300825各基因型表达率差异具有统计学意义(P<0.05)，经等位基因频率分析，妊娠组A等位基因频率为87.1%，未妊娠组A等位基因频率为80.0%，妊娠组A等位基因频率略高于未妊娠组，差异具有统计学意义(P<0.05)，通过对rs2300825位点各基因型OR值分析得出，rs2300825(A/G)、rs2300825(A/A)相比于rs2300825(G/G)可提高IVF-ET患者的临床妊娠率，OR值分别为1.526、2.769。因此，本研究结果提示rs2300825位点多态性与IVF-ET患者临床妊娠率存在一定的相关性，A等位基因的高表达可能为妊娠成功的保护因素。

HLA-DQ是体内重要的抗原提呈分子，而针对于IVF-ET患者，所移植胚胎在宫腔内种植成功是影响IVF-ET妊娠成功的一个重要因素，因此，推测HLA-DQ在这一过程中扮演着重要的作用，调控某些重要环节，在免疫性不孕不育中，其重要性已得到认可[11-12]。夫妻双方HLA-DQ分子相容性在多方面广为探讨，如淋巴细胞免疫治疗复发性流产效果、胚胎种植等方面，不同学者持不同观点。有学者认为夫妻HLA的相容性增加，更易形成纯合型胚胎妊娠，使母体的免疫调节失衡从而导致种植失败，这种情况下一般采取供者淋巴细胞主动免疫疗法，疗效较好[13]，但也有学者认为，HLA-DQA1/DQB1组织相容性增高对封闭抗体的产生无影响[14]。有学者通过研究反复种植失败患者与正常对照组相容性对比分析中，发现夫妻双方HLA-DQ相容性与胚胎种植成功与否无显著关联[15]。该学者同时认为，HLA-DQB1*03可能是一个导致IVF-ET患者反复种植失败的易感基因，而HLA-DQB1*05:02可能是一个保护性基因，这与本研究部分结果一致。

综上所述，HLA分子特定基因型的表达率影响着IVF-ET患者的临床妊娠率，其中，rs2300825 A等位基因的高表达为IVF-ET患者妊娠成功的保护因素，而rs2524005、rs2855591在本次研究中两组患者之间分布无明显区别，可能原因是本次研究中所纳入样本量较少而使分析结果呈阴性，仍需大量临床数据佐证，同时，日后可进一步研究夫妻双方HLA分子相容性对IVF-ET的影响。本次研究提示HLA基因多态性影响着临床妊娠率，但其相关机制如何及是否可以进行干预仍有待进一步的研究，这些研究结果将会对IVF-ET患者有所助益，从而提高IVF-ET患者妊娠率并进一步改善妊娠结局，具有一定的临床意义和社会学意义。