桃叶珊瑚苷舒张血管作用机制研究

张冬璇，王家龙，瞿晶田

（1.中国人民解放军联勤保障部队第九八三医院，天津 300142；2.中国中医科学院广安门医院，北京 100053；3.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

杜仲是一味具有降压作用的传统中药材，其发挥降压作用的有效成分主要包括木质素类、苯丙素类、环烯醚萜类和黄酮类化学成分[1-4]。所涉及的作用机制主要包括调节激素水平，改善内皮功能，调节钙离子通道开放等[5]。以往的研究证实，杜仲水提物和醇提物均具有舒张离体大鼠胸主动脉血管的作用，作用机制可能与促进内皮细胞一氧化氮的产生与释放相关[6]。桃叶珊瑚苷是一种存在于杜仲中的环烯醚萜类成分，具有舒张大鼠胸主动脉血管的作用[7]。本研究以大鼠胸主动脉环和心脏微血管内皮细胞为研究对象，探讨桃叶珊瑚苷舒张血管的作用及可能的作用机制。

1 药品、试剂与仪器

桃叶珊瑚苷购于中国药品生物制品检定所；L-NAME、NaCl、KCl、CaCl2、KH2PO4、MgSO4、NaHCO3、α-D-Glucose 购于索莱宝生物科技有限公司；去甲肾上腺素、乙酰胆碱购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胎牛血清、DMEM/F12 购于gibco 公司；MTT 增殖毒性试剂盒购于南京建成生物工程研究所；大鼠eNOS ELISA 检测试剂盒购于上海康朗生物科技有限公司。Maclab AID 生物记录软件（澳大利亚Powerlab 公司），Radnoti 组织器官灌流系统（美国Powerlab 公司）。

2 研究方法

2.1 大鼠胸主动脉环实验 将SD 大鼠（250～300 g）断头处死，迅速开胸，分离出胸主动脉，除去胸主动脉的周围结缔组织及脂肪组织，剪成4 mm 的血管环。用钩子将各血管环悬挂于含有Krebs 试液（PH=7.4，37 ℃，持续充入5% CO2和95% O2）的组织器官灌流浴槽内。应用NE（10-6mol/L）刺激收缩各血管环，而后加入累积浓度的桃叶珊瑚苷（0.5，5，20 μmol/L），应用Maclab AID生物记录软件对血管张力变化进行检测。Krebs 试液的组成：KCl 4.7 mmol/L，NaCl 118 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，D-Glucose 10 mmol/L；CaCl21.3 mmol/L。

2.2 细胞培养 将3～4 周龄SD 大鼠断颈处死，用75%的乙醇浸泡大鼠5 min 后，移至超净工作台，打开胸腔，取出大鼠心脏。采用胶原酶-中性蛋白酶混合消化法分离大鼠心脏微血管内皮细胞。细胞经CD31/vWF 免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上。细胞培养应用含体积分数为1%青链霉素和10%的胎牛血清的DMEM/F12 培养基。

2.3 MTT 法检测细胞活力 含有不同浓度桃叶珊瑚苷（0～20 μmol/L）DMEM/F12培养基作用细胞24 h，加入MTT 孵育2 h。吸去培养基，每孔加入150 μL DMSO，震荡10 min，使得结晶物完全溶解，在590 nm下测定吸光度。

2.4 ELISA 法检测eNOS 蛋白 含有不同浓度桃叶珊瑚苷（0.5，5，20 μmol/L）DMEM/F12培养基作用细胞24 h，ELISA 法对各孔细胞eNOS 蛋白进行检测。检测按试剂盒说明书操作进行，在450 nm 下测定吸光度。

3 结果

3.1 桃叶珊瑚苷血管舒张作用 与对照组相比，桃叶珊瑚苷（0.5，5，20 μmol/L）具有舒张内皮完整（+E）大鼠离体胸主动脉血管的作用（P＜0.01）。去内皮（-E）和L-NAME（100 μmol/L）均能够使桃叶珊瑚苷（0.5，5，20 μmol/L）舒张血管的作用减弱（P＜0.01），（见图1）。

图1 桃叶珊瑚苷血管舒张作用研究

3.2 桃叶珊瑚苷对大鼠心脏微血管内皮细胞活力的影响 不同终浓度的桃叶珊瑚苷（0～20 μmol/L）孵育大鼠心脏微血管内皮细胞24 h。与对照组相比，桃叶珊瑚苷对其细胞活力没有显著影响。

3.3 桃叶珊瑚苷对大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS 蛋白表达的影响 桃叶珊瑚苷（20 μmol/L，孵育24 h）具有促进大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS 蛋白表达的作用（P＜0.01），见图2。

图2 桃叶珊瑚苷对大鼠心脏微血管内皮细胞eNOS 蛋白表达的影响

4 讨论

药物发挥对血管舒缩功能的直接调控作用主要涉及快速效应和缓慢作用。快速效应方面，药物可以直接作用于血管内皮细胞，通过调控内皮细胞释放舒缩因子（如NO，PGI2 等），发挥对血管舒缩功能的调控作用[8-11]。药物还可以直接作用于血管平滑肌细胞，通过影响平滑肌细胞相关离体通道（如钙离子通道，钾离子通道等）的开放，发挥对血管舒缩功能的调控作用[12-15]。缓慢作用方面，药物可以通过调控内皮细胞舒缩因子的表达，以及平滑肌细胞相关离子通道的表达，发挥对血管舒缩功能的调控作用[16-17]。除此之外，病理状态下，内皮细胞与平滑肌细胞相关信号通路的改变亦与血管舒缩功能密切相关[18-19]。本研究发现桃叶珊瑚苷能够快速地舒张大鼠离体胸主动脉血管，去除血管内皮或加入一氧化氮合酶抑制剂L-NAME 均能够抑制桃叶珊瑚苷舒张离体血管的作用；与对照组相比，桃叶珊瑚苷对去内皮血管则未见明显的舒张作用。除此之外，孵育大鼠心脏微血管内皮细胞24 h，桃叶珊瑚苷具有促进eNOS 蛋白表达的作用。

综上所述，桃叶珊瑚苷对血管收缩舒张功能的调控具有快速作用及缓慢作用。快速作用发面，桃叶珊瑚苷能够通过内皮依赖的NO 途径发挥对血管的快速舒张作用；缓慢作用方面，桃叶珊瑚苷具有促进内皮细胞eNOS 蛋白表达的作用。文献报道，桃叶珊瑚苷可激活雌激素受体，其是否可通过雌激素受体发挥对血管舒缩功能的调控作用，需要更加深入的研究[20]。