家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫CTNND2基因的检测

刘彩霞， 孙 维， 田智敏， 陈秋惠， 史宝和， 孙亚娟， 李 佳

家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫(Familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE)又称良性成人家族性肌阵挛性癫痫(Benigh adult familial myoclonic epilepsy，BAFME)，是一种罕见的神经系统常染色体显性遗传疾病。尽管研究者已做了大量研究，但其发病机制仍不明确。目前在我国、日本、意大利、法国等多个国家已经发现了2p11-q12.2、10p15、8q23.3-24.1、5p15.31-p15、3q26.32-3q28等5个致病基因位点，我国报道的病例的致病基因位点主要位于5p15.31-p15和10p15，但目前尚未克隆出该病的致病基因。课题组在前期工作中通过连锁分析，将致病基因位点定位在5号染色体的某一区段[1]，经过对该区段相关基因的功能分析，预测CTNND2可能为该FCMTE家系的致病基因，因此本研究对该家系中7例患者进行CTNND2筛查，以明确该基因是否为该家系的致病基因。本文将对其检测结果做一报道。

1 对象与方法

1.1 对象 对确诊的家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫一家系包括先证者在内的7例发病者进行基因突变分析。此家系8例患者均成年发病，男女患病机会均等，除第Ⅳ代一人为可疑患病外，其余三代均有发病。发病成员无发育迟滞，多以震颤为首发症状，伴有癫痫发作、头痛等症状，癫痫主要表现为强直-阵挛发作，多伴有焦虑症状，智能受损不明显。口服地西泮、苯巴比妥、卡马西平等药物癫痫治疗有效，但口服β受体阻滞剂或饮酒震颤控制不明显。病情发展缓慢，无明显进展过程。符合2005年Van Rootselaar提出的“家族皮质震颤性肌阵挛性癫痫”的诊断标准[2]，家系图见图1。

图1 家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫家系

1.2 方 法

1.2.1 基因组DNA 提取获得受试者知情同意后，取其外周肘静脉血各5 ml，利用血液基因组DNA提取试剂盒(天根)提取各样本基因组DNA。

1.2.2 PCR检测 建立PCR反应体系进行PCR反应，用1.0%的琼脂糖凝胶进行 PCR产物电泳分析，割胶回收PCR产物并进行纯化。

1.2.3 基因突变检测 用于扩增的CTNND2基因编码区包括22个外显子的引物22对，根据CTNND2的gDNA序列，采用Primer3在线设计(由上海生物工程公司合成)，对PCR扩增产物进行测序，将GenBank人类CTNND2基因的gDNA序列与测序结果进行比较。CTNND2基因引物序列见表1。

表1 扩增CTNND2基因的引物

2 结 果

2.1 PCR检测结果CTNND2基因检测结果 见图2。

2.2 CTNND2基因突变检测 利用直接测序法对CTNND2基因进行测序，结果显示除先证者CTNND2-18号外显子序列只有F-前10bp判读不清外，其余患者该基因均未见突变(见图3)。

图2 先证者CTNND2 PCR检测结果图

图3 先证者CTNND2-18号外显子序列检测峰图(只有F-前10bp判读不清，其余未见突变)

3 讨 论

家族性皮质肌阵挛震颤性癫痫(Familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE)是一种罕见的神经系统常染色体显性遗传疾病。成年期发病，主要表现为四肢细微震颤或肌阵挛，以远端为著，伴或不伴癫痫发作，情绪紧张、光刺激或睡眠剥夺时易被诱发，抗癫痫药物可有效控制癫痫发作，而饮酒或使用β受体阻滞剂治疗无效，病程为非进展性。躯体诱发电位显示肌阵挛或震颤来源于大脑皮质。我们在临床工作中发现了一个FCMTE大家系，已对其临床特点做了报道[3]。

目前，在我国、日本、意大利、法国等多个国家已经发现了2p11-q12.2、10p15、8q23.3-24.1、5p15.31-p15、3q26.32-3q28等5个致病基因位点，该病的致病基因至今仍不明确，我国报道的病例的致病基因位点主要位于5p15.31-p15和10p15[4～7]。课题组在前期工作中通过对家系成员进行连锁分析，将致病基因位点定位在5p15.31-p15[1]，为进一步明确该家系致病基因，采用功能候选克隆的策略对候选基因进行筛查。通过在UCSC数据库中的Human Genome Browser中查询在5p15.31-p15之间的基因。根据癫痫的病理生理机制、已克隆的特发性癫痫致病基因特点，结合各个基因在该候选区域的表达及其生物学特性对候选基因进行选择，而后将致病基因锁定为CTNND2。

CTNND2 基因位于5 p15.2染色体上，是2p12 CTNNA2基因的旁系同源基因，编码连环蛋白(钙粘联蛋白相关蛋白)，它是连环蛋白家族中的一种，可能参与了神经细胞黏附。该基因在中枢神经系统和视网膜中的表达更丰富，在大脑功能中扮演重要角色，包括突触的监管[8，9]。

本实验我们利用PCR产物测序方法对受试者CTNND2基因编码区包括22个外显子进行筛选。尽管此次外显子筛查的结果为阴性，但仍不能完全排除该基因为致病基因。由于我们主要进行的是外显子测序，并且以编码区为主，未涉及非编码区，而非编码区的顺式作用对于基因的时空表达起关键作用，顺式作用元件的突变可能导致疾病发生。其次，除了基因本身的调控元件通过影响基因的表达水平导致疾病发生外，还存在修饰基因异常或修饰基因与基因间相互作用导致疾病发生的可能。另外，也不能除外嵌合突变的可能。但目前我们尚不考虑该基因为该家系致病基因，通过对该基因的筛查，虽暂时未发现阳性结果，但是能够帮助我们缩小了筛选范围。接下来，课题组将对候选区域的其他可疑致病基因进行筛查，必要的时候对家系成员进行全外显子测序以寻找致病基因。