人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定方法的研究进展

贾燕花

(国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022)

血液制品是由人类血液或血浆制备成的治疗产品，《中华人民共和国药典》2015年版收载品种有人血白蛋白、人免疫球蛋白等[1]。其中静注人免疫球蛋白(IVIG)制品是从1000名以上供血浆者的血浆混合物制备而成，具有免疫替代和调节的双重作用，目前被广泛用于感染性疾病和自身免疫性疾病的治疗[2]。

IVIG制品的临床疗效与其生物学功能密不可分，第1代和第2代IVIG生产方法均会损害人免疫球蛋白的Fc片段，进而影响其生物学功能[3]、制品的存放会导致人IgGFc段生物活性降低和退化，且实际生产工艺中有多种因素会影响Fc段生物学活性，因此需要对人免疫球蛋白进行Fc段的生物学活性检测。《中华人民共和国药典》2015年版三部也规定Fc 段生物学活性检测方法[1]，且《中华人民共和国药典》2015年版引入供试品激活补体的功能指数应不低于国家参考品活性的60%的要求。

目前报道有多种人免疫球蛋白Fc段生物学活性检测方法，如激活补体试验、结合Fc 受体的调理活性试验、巨噬细胞吞噬细菌作用试验、红细胞玫瑰花形成抑制试验、静注人免疫球蛋白与葡萄球菌A 蛋白结合试验、静注人免疫球蛋白与Fc 特异单抗结合试验及单向散射扩散溶血试验等[4]。《中华人民共和国药典》2015年版和《欧洲药典》[5]均采用激活补体检测方法，该方法具有干扰因素较少、操作较简单、检测结果较准确等特点，但也受一些因素的影响，如检测原理中采用单点标准品、供试品中抗体滴度、IgG亚型、抗原的种类及效价、补体的反应条件(补体效价、反应温度、抗原的致敏效价等)等[6]。笔者主要阐述激活补体检测方法的研究进展，就抗原、敏化红细胞、补体效价、检测方式等进行综述，为IVIG制品的质量控制提供参考。

1 人免疫球蛋白Fc生物学活性检测方法的比较

《中华人民共和国药典》2015年版和《欧洲药典》均收载Fc段生物学活性检测方法，检测方法的原理相同，检测步骤和溶血反应检测方法存在差异。

1.1抗原方面 《中华人民共和国药典》2015年版仅在敏化红细胞方法中表述了用磷酸盐缓冲液(PBS)适当稀释的白喉类毒素或腮腺炎病毒，无滴度要求，《欧洲药典》中规定风疹抗原的滴度>256HA units。

1.2敏化红细胞制备方面 在红细胞来源、红细胞悬液制备方法等方面均有差异。①《中华人民共和国药典》2015年版规定人抗凝O型血要求3人份以上混合，而未规定贮存条件，《欧洲药典》中存储条件要求为在4 ℃条件下≤3周。②红细胞悬液制备方法，《中华人民共和国药典》2015年版规定分离红细胞，取适量压积红细胞悬浮于1.3 mg·L-1鞣酸PBS(1：40)，37 ℃水浴轻摇30 min，洗涤后用PBS制备成2.5%红细胞悬液；《欧洲药典》规定分离后红细胞以2%(V/V)悬浮于PBS(pH值7.2)中，将1体积的鞣酸溶液与1体积的人红细胞悬液混合，37 ℃孵育10 min，洗涤后用PBS制备成1%红细胞悬液。③敏化抗原的制备，《中华人民共和国药典》2015年版规定红细胞悬液与抗原溶液混合比例为1：4，混合后置于37 ℃水浴中轻摇30 min；《欧洲药典》规定每毫升鞣酸化红细胞添加风疹抗原0.2 mL，置于37 ℃水浴孵育30 min，同时规定初始测定吸光度混合，按照敏化红细胞悬液100 μL和白蛋白-巴比妥缓冲液900 μL混合测定。

1.3补体方面 《中华人民共和国药典》2015年版仅在测定法中体现补体用量，每毫升含补体150 CH50，未提供补体的制备方法和贮存条件。《欧洲药典》规定豚鼠补体从不低于10只豚鼠的血液制备，提供制备方法和贮存条件，用量为每毫升含补体125～200 CH50。

1.4供试品和参考品制备方法 两者在供试品制备，浓度规定方面有差异，《中华人民共和国药典》2015年版规定将供试品pH值调节至6.8～7.0，再用牛白蛋白-巴比妥缓冲液将供试品IgG浓度稀释至每毫升含40 mg；《欧洲药典》中规定，将供试品用白蛋白-巴比妥缓冲液稀释获得免疫球蛋白30～40 mg，并用白蛋白-巴比妥缓冲液获得最终体积为900 μL的溶液。参考品的制备方法均同供试品。

1.5检测方式 《中华人民共和国药典》2015年版采用紫外-可见分光光度法检测，《欧洲药典》中同时收载紫外-可见分光光度法和微孔板光度法两种溶血反应检测方法。检测方法中，供试品和敏化红细胞混悬液混合后的处置条件不一致，《中华人民共和国药典》2015年版规定置37 ℃水浴中轻摇30 min，《欧洲药典》规定为静置15 min。

2 Fc段生物学活性测定法的优化

2.1抗原的种类和效价激活 补体是通过抗体的Fab段与相应的抗原结合后，IgG暴露出Fc结合C1q的补体结合点，启动补体激活系统，从而能有效的和快速的杀死病原菌。人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法是通过与红细胞上已包被的相应抗原结合，激活补体后最终导致红细胞的细胞膜受到攻击、破裂，从而释放出血红蛋白，由溶血反应动力学曲线来测定。关于红细胞上的包被抗原，《欧洲药典》相应方法中推荐采用风疹病毒抗原，《中华人民共和国药典》2015年版的相应方法中推荐采用白喉类毒素或腮腺炎病毒，且《欧洲药典》和《中华人民共和国药典》2015年版方法中均仅考察一种抗原特异抗体的Fc段生物学活性。

席亮等[7]分别考察白喉类毒素、风疹病毒、麻疹病毒、乙型肝炎表面抗原、破伤风类毒素和脑膜炎球菌P64k蛋白等6种抗原对Fc段生物学活性检测结果的影响，重复性比较稳定，检测结果依次为129%，132%，117%，98%，82%和118%，均高于80%，同一批次样品Fc段生物学活性检测结果差别较大，推测是由于供试品中不同抗原抗体滴度不同造成的。《欧洲药典》和《中华人民共和国药典》2015年版采用不同的抗原，表明Fc段生物学活性检测抗原的选择应该考虑供试品中针对该抗原的特异抗体滴度的水平，由于献浆员针对疫苗的免疫效果不同和抗体水平不同，因此，《欧洲药典》和《中华人民共和国药典》2015年版检测IVIG的Fc段生物学活性的抗原种类不同。该项研究引入麻疹病毒、乙型肝炎表面抗原、破伤风类毒素和脑膜炎球菌P64k蛋白这4个非药典收载的抗原，表明用多种抗原分别致敏红细胞可用来检测IVIG 中多种抗体的Fc 段生物学活性，为IVIG 制品中多种抗体Fc 段生物学活性奠定了基础。

敏化红细胞的抗原一般为类毒素或病毒，具有一定的环境危害性、批间质量差异性较大造成敏化效果不稳定等缺点。陈晨等[8]发明一项专利，采用更易获得的且具有良好稳定性的重组合成肽段(蛋白)类抗原，如重组风疹抗原E1或重组白喉CRM197，进行IVIG的Fc段生物学活性检定，且由于《中华人民共和国药典》2015年版方法采用吸光度测定法易受样品的澄明度、补体的批次等条件的影响，不利于数据的回顾性分析，因此对检测方法进行优化，采用细胞计数法直观检测红细胞溶血，检测结果的精密度为3.074%。《欧洲药典》检测结果的精密度为17.313%，采用重组风疹抗原E1或重组白喉CRM197具有可行性。

雷敏等[9]考察重组乙型肝炎疫苗致敏红细胞，该抗原的溶血动力学曲线几乎没有波动，未发生溶血反应；同时考察《中华人民共和国药典》2015年版推荐的白喉类毒素抗原，溶血反应动力学曲线呈现明显的“S”型，结果表明，浓度在50～150 Lf·mL-1时检测结果良好，因此，试验结果表明，虽然乙型肝炎表面抗原进行Fc段生物学活性检测具有可行性，但采用重组乙型肝炎疫苗致敏红细胞的检测方法暂不可行。

破伤风类毒素作为抗原可引起强烈的T细胞免疫应答，产生较高滴度的抗体，且破伤风检测属于多国规定的免疫项目。因此，VRDOLJAK等[10]考察破伤风类毒素作为抗原进行Fc生物学活性检测的可行性，研究发现，IVIG制剂的破伤风抗体滴度的批间差异不影响检测结果，且该方法的精密度达±5%。比较破伤风类毒素抗原与《欧洲药典》规定的风疹病毒抗原的检测结果，测定IVIG样品7份，两种方法平均差值为3.1%。该项研究中关于破伤风类毒素用于Fc生物活性检测的可行性结论，与席亮等[7]研究结论一致。

2.2敏化红细胞制备 《中华人民共和国药典》2015版收载的Fc段生物学活性检测方法中，敏化红细胞制备方法要求牛白蛋白-巴比妥缓冲液悬浮红细胞的浓度规定：波长541 nm处吸光度(A541)为1.0±0.1，《欧洲药典》的规定与《中华人民共和国药典》2015年版相同。刘晓等[11]考察Fc段生物学活性检测方法中敏化红细胞的密度和敏化红细胞贮存时间对结果的影响，结果显示细胞密度A541为0.3，0.5，1.0，1.3，1.5，2.0时，IFc依次为68%，66%，62%，73%，51%，52%，红细胞密度A541为1.3时，测定的结果最高。致敏红细胞贮存1～5 d时结果较为稳定，第1，2，3和5天的检测结果依次为88%，82%，84%，88%，而第7天时检测结果为100%，结果偏高，因此建议致敏红细胞贮存时间应不超过5 d。雷敏等[9]考察敏化红细胞对检测结果的影响，当A541为1.0时，测定的检测结果较高。大部分文献中敏化红细胞的密度与《中华人民共和国药典》中规定基本一致，刘晓等[11]等认为A541为1.3时检测结果最高，说明吸光度为Fc段生物学活性的影响因素，应注意平行比较时敏化红细胞浓度对试验结果的影响。

2.3补体效价和溶血反应检测方法 添加补体的用量，《中华人民共和国药典》规定为150 CH50·mL-1，《欧洲药典》规定为125～200 CH50·mL-1，雷敏等[9]采用白喉类毒素进行补体效价的考察，以溶血动力学曲线是否呈现明显“S”型为判断标准，提出补体效价≥50 CH50·mL-1时均能获得较好的溶血反应曲线。

2.4溶血反应检测方法 《中华人民共和国药典》2015年版采用紫外-可见分光光度法检测，《欧洲药典》同时收载紫外-可见分光光度法和微孔板光度法。刘晓等[11]考察手工紫外-可见分光光度计和微孔板光度法对结果的影响，对同一批样品的10次结果重复性进行考察，两种检测结果相近，其中微孔板的变异系数相对较低。VRDOIJAK等[10]考察微孔板光度方法同时检测白喉类毒素和破伤风类毒素的Fc段生物学活性，结果精密度良好。

3 结束语

人免疫球蛋白Fc段生物学活性主要有激活补体、抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用以及通过胎盘的的被动免疫等，通常要求IVIG的生产工艺尽可能少修饰IgG，保留IgG分子的完整性，尽可能保留Fc段的生物学活性。静注人免疫球蛋白(pH 4)为《中华人民共和国药典》2015年版收载品种，所采用的生产工艺应能使制品中IgG亚类齐全，其值与正常人血清IgG亚类分布相近，应能保留IgG的Fc段生物学活性，并在通则中提供Fc段生物学活性检测方法。

《中华人民共和国药典》2015年版中人免疫球蛋白Fc 段生物学活性检测方法为激活补体检测方法，相关文献提供采用了重组抗原进行检测的研究数据，也提供其他类型抗原，如破伤风类毒素等研究数据；关于敏化红细胞方面，考察敏化红细胞的浓度，基本与《中华人民共和国药典》2015年版规定一致，同时考察敏化红细胞的贮存条件，为试验操作的灵活性提供数据支持；补体效价方面，文献中提出≥50CH50·mL-1均能获得较好的溶血反应曲线；关于溶血反应检测方法方面，微孔板光度法变异性低，精密度良好，可同时进行多个样品检测，提高检测效率。人免疫球蛋白Fc 段生物学活性检测方法激活补体方法为标准方法，在实际首次应用时，应对该方法进行适当的验证，如进行专属性和精密度的验证，以便证明在实际的使用条件下该方法也适用。