基因芯片在牙周微生物检测中的研究进展

张艺龄，徐杰

(昆明医科大学附属口腔医院牙周病科，昆明650000)

牙周炎是一种多因素共同影响的，累及4种牙周支持组织(牙龈、牙周膜、牙骨质及牙槽骨)的炎症性和破坏性疾病[1]，牙周微生物是牙周炎的始动因素。部分牙周微生物具有显著的毒性或致病性，通过多种机制干扰宿主防御能力，直接或间接引发牙周组织破坏，在牙周炎的发生和发展中发挥重要作用[2]。因此，了解并检测牙周微生物有利于进一步明确牙周致病微生物，针对性选择特异性药物，评估患者预后。检测致病微生物的方法有很多，如分离培养法、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，其中PCR应用最广泛。随着基因组计划的快速发展，基因芯片技术也开始用于疾病研究，具有简便快速、灵敏度高、特异度高及自动化等特点[3]。越来越多的学者开发并利用基因芯片检测牙周微生物，分析不同牙周疾病中口腔微生物群的特点和变化，以期进一步了解牙周疾病与牙周微生物的关系[4-5]。基因芯片技术有助于牙周病的病因、诊断、治疗以及预后评估的研究。现对现有基因芯片技术及其应用于牙周致病微生物检测的情况进行综述。

1 牙周微生物及常规检测方法

口腔中有700多种微生物，以细菌为主，其中绝大部分细菌为口腔正常细菌，仅部分细菌与牙周病的发生、发展相关，具有显著的毒力或致病性，通过多种机制干扰宿主的防御能力，具有引发牙周破坏的潜能，称为牙周致病菌[6]。目前已知的牙周致病菌有11种，包括伴放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌、福赛斯坦纳菌、具核梭杆菌等。除已知的牙周致病菌外，口腔中还存在一些与牙周炎发生发展密切相关的细菌，如厌氧消化链球菌、侵蚀艾肯菌，其在牙周炎的龈下菌斑中的检出率较高[7]。在牙周病的病因学研究中，除细菌外，病毒(如疱疹病毒)也在牙周病的发生中发挥作用[8]。人巨细胞病毒、EB病毒和单纯疱疹病毒1型可能是与牙周病进展有关的疱疹病毒[9-10]。这些病毒通过降低宿主抵抗力，为牙周细菌的定植和繁殖创造条件，进而快速破坏牙周组织[8]。有研究表明，牙周细菌和疱疹病毒共同感染会增加侵袭性牙周炎的患病风险[11]。由于口腔微生物群是一个高度复杂的生态系统，因而有学者认为牙周菌群与宿主的生态失衡是牙周炎形成的原因，并非由某些牙周细菌决定[12]，所以了解并检测牙周微生物有重要意义。另外，侵袭性牙周炎和部分慢性牙周炎患者进行基础治疗后仍需辅助性使用抗生素[13]，而不恰当的抗生素治疗可能会造成致病菌的耐药[14]，所以针对性用药显得更为重要，而最佳抗生素方案的选择应基于微生物分析。

常规检测致病微生物的方法主要是分离培养法和PCR。分离培养法是检测微生物的金标准，但该方法只针对活菌，且培养周期长，耗时费力，特别是对于牙周致病菌中的厌氧菌，培养条件高且不易成活，因而应用具有一定的局限性[15-16]。相较细菌分离培养法，常规PCR及其衍生技术解决了厌氧菌不易培养的问题，缩短了检测周期和步骤，提高了检测的灵敏度和特异度[7,17]。但常规PCR一次只能检测一种已知的优势菌群，不能同时检测多个菌种，对于多种细菌共同感染的复杂样本不能很好地分析细菌的多样性，且只有实时荧光定量PCR能进行致病微生物的定量分析[18-19]。随着科学技术的发展，具有局限性的常规检测方法已不能满足研究者的检测要求。

2 基因芯片技术

2.1基因芯片概念 基因芯片又称DNA微阵列、DNA芯片，是将大量特定的已知的DNA序列有序地固定在固相载体表面，然后与标记的待测样品进行杂交，通过荧光检测系统对杂交信号进行扫描分析，继而获得大量与基因相关的信息[20]。探针序列最常选自GeneBank和RDP等数据库[18]，而要分析的样品可以是PCR产物、互补DNA、基因组DNA、质粒DNA或寡核苷酸等[16]。检测时样本先行PCR扩增后掺入荧光或放射性同位素进行标记，再将设计合成的基因芯片与样品中的RNA或DNA序列杂交[3]，通过检测从样品杂交中获得的荧光信号强度分析核酸量，进而估计样本微生物的数量或基因表达水平[5]。

2.2基因芯片的优缺点 基因芯片的主要优势是高通量、多样性、并行性、自动化和准确性[3]，其能在几小时内同时检测出多种微生物，与细菌培养法和PCR相比，很大程度上缩短了检测的时间和工作量，是一种快速、简便、特异、高通量的检测技术[21]。该技术还能检测多种细菌，同时分析细菌菌群的多样性和丰富度[22]。刘杰等[18]成功制备了包含11种腹泻相关致病菌基因的检测芯片，该基因芯片检测的灵敏度较PCR技术高10倍。基因芯片也有不足之处，其是针对已知微生物设计的寡核苷酸探针，并不能检测未知微生物[23]，且目前基因芯片采用定性半定量的快速检测方法[22]，对于需要定量检测的微生物仍需借助实时荧光定量PCR技术才能实现。

3 基因芯片在牙周微生物中的应用进展

基因芯片技术可用于分析微生物的基因组，进行微生物基因分型与微生物种类鉴定[24]，也可分析基因表达及微生物感染期间宿主基因表达变化[25]，筛选监测微生物抗药性的基因[26]，用于癌症等疾病的诊断[27]。有研究者利用基因芯片检测牙周微生物，分析不同牙周疾病中口腔微生物群的特点及变化，其中人类口腔微生物鉴定芯片(human oral microbe identification microarray，HOMIM)在口腔微生物群检测中应用广泛。

3.1HOMIM的应用

3.1.1HOMIM HOMIM由美国波士顿Forsyth研究所基于细菌16S rRNA基因片段研发，包含400多对探针，用于检测300多种口腔细菌的基因芯片[28]。HOMIM将基于16S rRNA反向捕获的DNA探针固定在载玻片上，使用16S rRNA通用引物扩增样本DNA，并在扩增中掺入荧光素进行标记，将标记的扩增片段与HOMIM上的探针杂交，使用Axon 4000B扫描仪扫描微阵列玻片并提取数据[22]。HOMIM的读数为每个检测序列的相对信号强度，范围为0～5，信号越强检出率越大[29]。与常见的牙周致病菌检测技术相比，HOMIM 扩大了样本检测的细菌种类，很大程度上减少了工作量和工作时间[30]，其可以像高通量测序一样同时获得DNA样品中菌群组成的多样性和丰富度[31]。有研究者比较了HOMIM和高通量测序对牙周菌群组成的检测情况发现，两种检测方法在物种检测上基本一致，但高通量测序在同一样品中检测到的物种数量是HOMIM的2倍[32]。也有研究者发现，HOMIM虽然在物种检测广度上没有高通量测序大，但在龈下菌群的特定菌种检测方面灵敏度更高[33]。

3.1.2研究菌斑生物膜相关菌群 菌斑生物膜是牙周炎形成的始动因子，随着疾病进展，菌斑生物膜相关菌群也发生变化[12]，通过HOMIM可研究菌斑生物膜的形成，为牙周炎的病因学研究提供依据[34-35]。有学者采用HOMIM研究早期菌斑生物膜形成过程中细菌群落多样性与时间的关系，动态分析早期菌斑生物膜细菌群落的组成[22]。HOMIM也可用于研究干预措施(口腔卫生宣教)对菌斑生物膜相关菌群的影响，为疾病的预防提供理论依据[36]。以上研究提示，HOMIM可动态分析菌斑生物膜的形成和不同干预措施对菌斑生物膜的影响，有助于牙周炎的病因学研究。

3.1.3研究不同牙周病的相关菌群 牙周病分为牙龈炎、慢性牙周炎(轻度、中度和重度)、侵袭性牙周炎(广泛型和局限性)和种植体周围炎等。口腔微生物群是一个复杂的生态系统，明确不同牙周疾病相关菌群的组成和差异，能够进一步了解牙周病的发病机制，有助于牙周病的病因学研究和诊断[12]。HOMIM可用于研究难治性牙周炎、重度牙周炎、可治性牙周炎和牙周健康者龈下菌群的组成和差异[5,28]，为评估牙周病的预后及制定后续治疗方案提供信息。HOMIM还被用于比较广泛型侵袭性牙周炎和牙周健康者龈下菌群的组成和差异，研究龈下菌群与性别、年龄和临床参数的关系[30]。种植体在口腔内受菌群影响也会发生种植体周围炎，治疗种植体周围炎过程中，HOMIM可用于分析釉质基质衍生物对种植体周围炎再生治疗的效果[37]。以上研究提示，HOMIM可用于分析不同牙周病和不同干预措施下的菌群组成和差异，有助于牙周病的病因研究、诊断和治疗。

3.1.4研究系统疾病与牙周菌群的关系 牙周微生物不仅与牙周病的形成有关，还可作为病灶与全身系统性疾病相关，分析系统疾病患者的牙周菌群，能更好地了解两者之间的关系。Albandar等[31]使用HOMIM研究掌跖角化-牙周破坏综合征患者的龈下菌群组成发现，患者的龈下菌群组成和慢性牙周炎和侵袭性牙周炎的龈下菌群相似。Bassir等[38]使用HOMIM检测了Hutchinson-Gilford早衰综合征患儿牙龈退缩部位的龈下菌群组成，未发现典型的牙周致病菌，而是口腔卟啉单胞菌和齿龈普氏菌，提示其他细菌可能与该病的牙龈退缩有关。糖尿病的发生发展与牙周炎相互影响，采用HOMIM检测发现，龈下菌群变化与糖尿病患者全身炎症和胰岛素抵抗有关[29]。以上研究评估了系统疾病与牙周组织破坏相关菌群间的关系，提示龈下微生物群可作为部分系统疾病状态的潜在标志。

3.2商品化基因芯片的应用 用于检测口腔微生物的商品化基因芯片是根据选定细菌设计合成并投入生产的成品，包括ParoCheck®试剂盒、StomaGene®试剂盒等。商品化的基因芯片所包含的细菌探针从几种到十几种，主要用于选定细菌的鉴定，特别是多种微生物感染的快速检测。商品化的基因芯片是一种可靠的微生物检测方法，可用于检测不同牙周状态下细菌的组成和差异，分析牙周炎与牙周细菌的关系，具有较高的灵敏度和特异性。商品化基因芯片可通过检测牙周致病菌辅助诊断和治疗牙周炎[39]。有研究者用商购的StomaGene®试剂盒和ParoCheck®试剂盒分析患龋儿童牙龈炎症部位和健康部位的牙菌斑发现，StomaGene®试剂盒和ParoCheck®试剂盒对不同细菌检测的灵敏度不一样[40]，提示应考虑用多种试剂盒检测同一样本以提高牙周细菌的检出率。商品化的基因芯片具有快速、简便、灵敏、特异等优势，可用于监测不同牙周炎菌群中常见牙周细菌的组成和变化，为牙周炎的诊断和治疗提供帮助。此外，由于商品化的基因芯片质量不一，应考虑用多种试剂盒提高牙周微生物的检出率。

3.3基因芯片的应用前景 除HOMIM和商品化的基因芯片外，也可以根据需要开发新的基因芯片，用于检测不同牙周疾病样本或同一疾病不同部位的样本[41]。基因芯片除了可以检测细菌外，也可检测真菌、病毒等，或根据需要在基因芯片上自由设计寡核苷酸探针用于检测所需的微生物[27,42]。Yang等[43]研发并验证了一种包括16种细菌、5种病毒、4种寄生虫和2种真菌探针的DNA微阵列用于检测腹泻患者粪便，为胃肠道感染的病因学研究和诊断提供依据。Debaugnies等[44]用DNA微阵列检测了造血干细胞移植患者血液样本中的疱疹病毒发现，DNA微阵列较常规PCR能更快速检测出人巨细胞病毒和EB病毒。目前应用于牙周微生物检测的基因芯片主要检测细菌，未考虑病毒特别是疱疹病毒在牙周炎中的作用[8,10]，而病毒相关的基因芯片也有其应用前景和理论依据，这对以后设计并应用细菌和病毒等结合的基因芯片有一定指导意义。

4 小 结

检测微生物的方法多种多样，而基因芯片技术因具有高通量、多样性、并行性、自动化、准确性、特异性和灵敏度高及简便快速等优点，已经成为一种不可替代的快速、准确和批量检测牙周微生物的方法。基因芯片既可检测细菌、真菌、病毒，也可根据需要在基因芯片上自由设计寡核苷酸探针用于检测所需的微生物。基因芯片技术有利于快速明确致病微生物，分析样本中微生物的多样性和丰度，有助于研究牙周病的病因、诊断、治疗和评估预后。但基因芯片只能检测已知微生物，并不能检测出未知微生物，且目前基因芯片采用的是定性半定量的快速检测方法，对于需要定量检测的微生物仍需借助实时荧光定量PCR技术实现。如何在基于基因芯片的优势上，实现对未知微生物的检测将是未来研究的热点。