CRISPR/Cas9 和碱基编辑器——农业动物研究领域的新利器

江浩筠，幸宇云

（江西农业大学 省部共建猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室，江西 南昌 330045）

自20世纪80年代起，转基因技术及其产品逐渐进入公众的视野，引发了大众的广泛专注，也产生了针对转基因技术安全性的激烈争论。当今时代，日新月异的技术革新正向我们昂首走来，3D打印、人工智能、云计算、人造肉、商业载人航天飞船等，在各类新闻报道中不断涌现。作为在现代生物技术中占有重要地位的转基因技术，也产生了革命性的技术创新，逐步升级成更高效、更安全的基因组编辑技术，近几年又衍生出碱基编辑技术，使得科研人员能“轻而易举”地对基因组进行特定位置单个碱基的精准修饰。本文以科普的写作手法，简述了转基因技术由“传统粗放”到“现代精细化”的发展历程，剖析了基因组编辑技术相比传统转基因技术在生物安全性上的优势，并重点阐述了基因组编辑的代表性技术——CRISPR/Cas9及其衍生技术（碱基编辑器）在农业动物研究领域可以发挥的作用。

1 传统的转基因技术及应用

转基因技术是指将人工分离和修饰过的基因导入到受体生物中，使导入的外源基因在受体中表达并引起性状改变的技术。自1982年全世界第一只产生明显性能改变的转基因动物[1]和1983年全球第一例转基因植物[2]研制成功以来，转基因技术在生物技术领域发挥了举足轻重的作用，对人类生活产生了重要的影响。在植物领域，抗虫棉花、抗虫水稻、抗虫玉米、抗除草剂大豆、抗病毒木瓜、耐储存番茄等转基因产品， 早已渗入到公众的日常生活中。 以美国为例， 美国是最早进行转基因作物商业化种植的国家，也一直是转基因作物的种植和消费大国，转基因食品已成为美国民众餐桌上的“家常便饭”[3-4]。在动物研究领域，转基因技术也发挥了出色的作用。2006年，利用转基因山羊乳汁中产生的抗人凝血酶III蛋白，成为了国际上首例获准上市的由转基因动物生产的基因工程蛋白药物，为患有先天性抗凝血酶缺失症的病人带来了福音；又如，科学家们研制的各种转基因小鼠模型，为人类健康和医学发展做出了重要的贡献。不过对于科研工作者，转基因技术有个“令人头疼”的地方，那就是外源基因整合入受体生物时，往往比较“随心所欲”，整合的位置和数量都不太容易操控。

虽然转基因技术为人类社会做出了重要的贡献，从第一种转基因食品上市至今也有近30年的历史，但不少民众对转基因食品的安全性仍存在疑虑。担心的焦点问题之一是，食用转基因食品后，转入基因所表达的蛋白质是否会对人的健康产生不利影响？另外，转入的基因一般需要“安装”在一个载体上，载体中的骨架序列也会进入到受体中，这些序列是否会存在一些潜在的威胁呢？非常明晰的是，所有生命体的DNA序列都是由A、T、C、G四个碱基按不同的排列组合所构成，而我们每天所进食的动植物产品，也都是由DNA及其所表达的蛋白质所组成。这些物质进入人体后，都将被酶分解成小分子；从这个角度看，转基因食品和传统的食品是无差别的。还有，自然界中广泛存在的杂交动植物品种，即是不同品种之间大量DNA的重新组合，这本身就是一种“广义的转基因”。需要说明的是，所有的转基因食品在上市前均需经过严格、系统、复杂的生物安全评价，只有评估合格的才能走向市场；转基因产品上市至今，其中的转基因大豆、玉米和油菜等大规模生产、食用，均未发现安全性问题。正是由于转基因技术有目共睹的贡献及长期论证后的安全可靠，2016年近百位诺贝尔奖获得者联名签署公开信支持转基因技术，截止2019年11月，签名的诺贝尔奖得主人数达到了151位，这代表了科学家群体共同的声音。

2 基因组编辑技术及其在动物研究领域的应用

传统的转基因技术会带入除目标基因之外的多余序列，且整合一般是随机的，这是导致安全争论的重要原因之一。那是否有更精准的技术以克服上述问题呢？答案是肯定的，这就是基因组编辑技术。基因组编辑是指利用特异性的核酸酶切割目标DNA序列，然后通过不带“模板”的修复敲除基因、或通过带“模板”的修复以修饰基因组。相比传统的转基因技术，基因组编辑技术的安全性得到了显著提升。基因组编辑技术有“指哪打哪”的技术特长；另外，修复“模板”的两端（称为同源臂）与受体的DNA序列完全相同，同源臂之间是想要导入的目标序列，除目标序列外不会带入多余的序列。迄今已成功应用的基因组编辑技术有ZFN、TALEN和CRISPR-Cas，这3种技术分别在2002、2011和2012年被报道成功应用[5]。在这3种技术中，CRISPR-Cas“家族”中的CRISPR-Cas9系统，因其操作简单、效率高、成本低等原因而备受推崇。CRISPR-Cas9系统是在CRISPR上“装载”一段目标DNA中的特有序列（约20个碱基），这段特有序列在CRISPR中发挥“精确制导”的作用，指挥Cas9酶将特定位置的DNA双链切开一个口子，然后在修复的过程中通过人为设计的“模板”以精准修饰基因组，或不添加“模板”以实现基因敲除。

CRISPR-Cas9可以说是生命科学领域中的一项革命性技术，该技术从诞生到现在不到10年的时间，但其应用呈现出爆发式增长，在许多研究领域都取得了众多“亮眼”的成果，其中包括在农业动物领域。这里列举几项代表性成果。结核病是一种人畜共患病，该病是奶牛场每年的必检疫病，因为病牛可能通过奶源将结核传染给人。研究表明，动物体内NRAMP1（天然抗性相关巨噬蛋白）基因的表达量若提高，可以增强抗结核的能力。西北农林科技大学张涌院士团队，利用CRISPR-Cas9技术，将牛一个拷贝的NRAMP1基因定点“放置”在DNA序列中的一个相对安全的位置上 （这种位置在基因组中俗称为“安全港”） ，叠加牛体内原有的NRAMP1基因后， 基因编辑牛表现出更强的抗结核感染能力[6]。 在比利时蓝牛群体中，有部分个体身上（特别是臀部）的肌肉一块块突出，被称为“双肌臀”[7]；科学家们研究发现，比利时蓝牛的这种表型是由于MSTN（肌肉生长抑制素）基因的自然缺失突变所造成的。在羊、狗等动物中也存在因该基因自然突变导致的“双肌”现象，但在猪中暂未发现类似的自然突变。多个科研团队利用CRISPR-Cas9技术，精准模拟了MSTN的自然缺失突变，使编辑猪也获得了“双肌”表型[8-10]。猪肉是全球餐桌上重要的肉类来源之一，近些年全球每年的生猪出栏量都超过了10亿头。另外有意思的是，与小型哺乳动物相比，猪在遗传、体型大小、解剖特点、生理代谢和疾病特征上都与人更为相似，因此被公认为是一种理想的疾病模型动物。亨廷顿舞蹈症是一种罕见病，患者表现出不停地“手舞足蹈”等病症，病情会逐步恶化直至死亡。研究表明，该病是由于一个名为Htt基因中CAG的序列重复次数异常增加所造成的，该突变造成患者脑部的一种神经元选择性死亡，从而产生“舞蹈症”。中科院赖良学研究员课题组和美国华人李晓江教授团队合作，利用CRISPR-Cas9技术，用患者的CAG重复序列替换掉猪相应位置的序列，获得的基因编辑猪也表现出“舞蹈症”及典型的脑部特定神经元选择性死亡[11]。而脑部特定神经元选择性死亡这一典型病理特点， 是过去在小鼠等动物模型长期研究中都无法获得的。 该研究成果一经报导，在国际上引起了轰动。上述几个例子中，都是先在实验室培养的细胞中，利用基因组编辑技术“修改”序列，然后针对编辑好的细胞开展克隆工作以获得基因编辑个体。这几个例子生动地说明，基因组编辑技术在农业动物品种改良中可以发挥出“立竿见影”的效果。通过该技术创制的精准动物疾病模型，可以很好地服务于人类健康医学和药物研发。

3 碱基编辑器及其在动物研究领域的应用

CRISPR-Cas9 技术因其出彩的表现而倍受科研人员的喜爱，然而，该技术在实施精准修饰时要将DNA 双链都打断，这引发了一些人对基因组稳定性是否会受到威胁的疑虑；另外，在精准修饰时一定要添加修复“模板”，即使是只“修改”DNA 序列中的一个碱基，“模板”在发挥作用时也可能“不听使唤”。该技术是否有进一步升级的空间呢？美国基因组编辑技术大咖之一——哈佛大学的 David Liu（刘如谦）教授的团队实现了新突破。他们分别利用胞嘧啶脱氨基酶和腺嘌呤脱氨基酶，与人为突变后的CRISPR-dCas9（Cas9 蛋白丧失切割功能）或 CRISPR-nCas9（Cas9 蛋白只切割 DNA 的一条链）系统相结合，使 DNA 序列中的 C 转变成 T[12]、 A 转变成 G[13]。 碱基编辑器有如“一支带橡皮擦的铅笔”，将目标位置上 C/A碱基的组成元件修改后即变成了 T/G 碱基；该过程无需切割 DNA双链，也不需要修复“模板”的参与，且 效率非常高。这 种利器可以精准地改变DNA序列中某个特定碱基，且 不导入任何的外来序列，从这点来说是非常安全的。要知道，在每个人的人生长河中，都可能自然产生成千上万个以上的突变。此外，通过碱基编辑器，可以在一个基因中将 CAG 中的 C 改变成 T，由于 TAG 属于基因的终止密码子，这样的改变使得基因的表达提前被终止了，这等同于基因敲除，但又不会导致双链 DNA的断裂。

碱基编辑技术问世以来被寄予了厚望，因为一半以上人类疾病的发生都是由于单个碱基突变所造成的，碱基编辑器为这些疾病的治疗提供了无限想像的空间。农业动物领域的很多重要经济性状也是由单个碱基的变化来调控的，利用碱基编辑器改良品种性状或研制人类疾病模型，具有巨大的应用潜力。例如，SOCS2基因与生长发育显著相关，科研人员利用碱基编辑技术，将绵羊该基因中的一个重要位点由C“修改”成 T 后，基因编辑羊生长速度明显高于未经编辑的羊[14]。针对兔的MSTN基因，科研人员通过碱基编辑器，将一个 C“修改”成 T 后，提前产生了终止密码子，与上述通过 CRISPR-Cas9 技术获得的基因敲除猪相似，基 因编辑兔也表现出“双肌”表型，但 后者仅仅是“修改”了一个碱基，没 有切断DNA双链[15]。 中国农业大学吴森老师课题组，利用碱基编辑器，将猪TWIST2中的一个 C 转变成 T 后，基因编辑猪表现出眼睑缺损-巨口综合征，精准地模拟了该基因突变在人中所产生的表型[16]。另外，碱基编辑器还有一个明显的优势，那就是由于其编辑的高效性，该技术可以较轻松地同时编辑多个位点。

4 结 语

CRISPR-Cas9 技术问世至今不到十年的时间，而碱基编辑器的发展历程就更短；即使在这么短的时间内，这两种技术体系已表现出势不可挡的发展态势。诚然，任何一种新鲜事物，其在诞生的初期都会或多或少存在一些问题，对于 CRISPR-Cas9 和碱基编辑技术，目前表现最为突出的问题就是可能存在脱靶的情况。不过我们坚信，随着科研人员在基因组编辑领域的不断深入探索，将不断会有更安全、更高效的基因组编辑工具出现，为整个人类社会提供更出彩的服务。