胃癌相关性microRNA的研究进展

梁先春 黄秋林

南华大学附属第一医院，湖南省衡阳市 421001

胃癌(Gastric cancer，GC)是亚洲最常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和死亡率。尽管目前在早期GC的检测和管理方面取得了一些进展，但大多数患者仍是处于晚期阶段才被诊断出来，随着胃癌侵袭性入侵或淋巴转移，尽管采用传统疗法，如手术、放疗、化疗或中药等联合治疗的方式加强治疗效果，胃癌的治疗效果仍不理想[1]。因此，进一步了解该病的分子发病机制、鉴定新的分子生物标志物对于早期诊断胃癌及改善目前胃癌的疗法具有重要意义。

miRNA是内源性非编码小分子RNA，长度为19～24核糖核苷酸的一个子集。首先是在线虫秀丽隐杆线虫中发现了miRNA，然后在植物和动物中发现许多这样的分子。在活细胞中，miRNA分子被Drosha和Dicer酶修饰，诱导转录后靶向mRNA的降解或沉默，从而抑制蛋白质的合成。据预测，人体中大约30%的mRNA是miRNA靶标，并且每种miRNA可以调节数百种基因。它们在器官发育、分化和功能以及肿瘤形成、进展、侵袭和转移中起作用[2]。miRNA功能的研究证明它们可能是癌基因或肿瘤抑制基因。miRNA的作用取决于其靶基因，靶向致癌基因的miRNA可以充当肿瘤抑制因子，而靶向肿瘤抑制因子可能是一种潜在的致癌基因。同时，miRNAs的表达和功能受基因序列、磷酸化水平、miRNA修饰酶等多种因素的调控。最近许多关于miRNA的研究揭示了其参与包括胃癌在内的不同肿瘤的发病机制。

1 miRNA在胃癌的作用及机制

1.1 miRNA对胃癌细胞增殖、凋亡的作用 在正常组织或细胞与肿瘤中具有差异表达的miRNA主要可分为抑制肿瘤细胞增殖的肿瘤抑制因子和促进肿瘤晚期生长和细胞增殖的癌基因。miR-17-5p、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-106-a和miR-155的异常表达与致瘤性相关，并且在许多类型的癌症中可检测到其升高的水平[3]。一些miRNA可以通过直接或间接调节癌基因或肿瘤抑制基因来促进胃癌的发展。在胃癌中miR-17、miR-18a/b、miR-19a、miR-20a/b、miR-21、miR-106-a/b、miR-340、miR-421和miR-658是高表达的，且其功能具有相关性，都是通过降低肿瘤抑制基因Rb和PTEN(磷酸酶和蛋白同源物)的水平来促进肿瘤生长，这些miRNA可能在加速胃癌的发展中发挥着作用[4]。

另一方面，部分miRNA则发挥着肿瘤抑制作用。最近的研究表明miRNA在胃癌中的关键调节作用和胃癌细胞中microRNA-141(miR-141)的异常表达[5]。研究者招募了30名胃癌患者进行miR-141水平检测，随访115周。用miR-141模拟物或抑制剂转染人腺癌细胞系AGS，用于细胞活力，集落形成和细胞周期测定。通过导入转染miR-141的AGS细胞构建胃癌小鼠模型。胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)在AGS细胞中过表达以研究miR-141机制。结果显示miR-141在胃癌组织中显著下调(P<0.001)；miR-141抑制AGS细胞活力(P<0.01)、集落形成P<0.01)和细胞周期(P<0.05)，导入miR-141模拟物细胞的小鼠肿瘤体积明显变小(P<0.01)，提示miR-141的抗增殖作用。磷酸化和总IGF1R蛋白水平均被miR-141抑制，而IGF1R过表达逆转了miR-141在AGS细胞增殖中的作用。以上研究表明miRNA可通过特异性的靶基因调节肿瘤细胞的增殖，从而密切参与GC的发展和进展。

1.2 miRNA对胃癌细胞迁移、侵袭的作用 局部侵袭和淋巴，血源性和腹膜转移是胃癌扩散的主要途径。胃癌患者转移的常见部位是淋巴结、肝、腹膜和网膜。最近的研究表明，多种miRNA与GC转移过程有关。GC转移的过程包括几个步骤，例如迁移/侵袭、EMT等，在这些过程中涉及许多miRNA的调控。

在已知的miRNA中，miR-135a已被证实为几种癌症类型中的肿瘤抑制剂，而其在胃癌中的作用和机制仍然很不清楚。因此有研究者通过进行定量PCR(qPCR)以检测配对的GC组织以及细胞系中miR-135a的表达，进行伤口愈合和transwell检测以确定miR-135a在GC细胞迁移中的作用，双荧光素酶报告基因测定，qPCR和蛋白质印迹分析用于验证miR-135a靶向TRAF5和随后的NF-κB途径，并通过进一步实验解释TRAF5参与介导miR-135a在GC细胞中的抗迁移作用。最后，在配对的GC组织中检查TRAF5的表达。结果表明miR-135a在GC组织和细胞系中表达减少，过表达miR-135a抑制了GC细胞的迁移，miR-135a靶向TRAF5和下游NF-κB途径是它在GC细胞迁移中发挥抑制作用的一种机制[6]。

同样的，研究者为了证实miR-103的临床意义，并探讨其在GC中的生物学作用和潜在机制。通过实时定量PCR显示miR-103在GC组织和细胞系中高度表达，临床特分析显示miR-103表达与肿瘤大小、Lauren分类和淋巴结转移密切相关。体外实验用miR-103抑制剂转染下调miR-103显著抑制体肿瘤细胞的迁移和侵袭。此外，miRNA靶标数据库和荧光素酶报告基因测定证实Krüppel样因子-4(KLF4)是GC中miR-103的直接靶标，并且GC组织中miR-103和KLF4表达之间存在显著的负相关，而KLF4下调可以抑制miR-103对GC细胞迁移和侵袭的致癌作用。因此，这些结果表明miR-103过表达可促进胃癌的进展，其机制可能与抑制KLF4的表达有关[7]。以上研究证实miRNA与GC迁移/侵袭的过程有关。

1.3 miRNA对胃癌细胞上皮—间质转化(EMT)的作用 肿瘤细胞中上皮—间质转化(EMT)的表达水平与肿瘤细胞的能力如迁移、侵袭和转移有关，而许多miRNA与各种类型的癌症中的EMT表型相关，这其中也包括胃癌。如有研究者发现miR-7在高转移性GC细胞系和转移组织中显著下调。 功能获得和功能丧失实验均显示增加的miR-7表达显著降低了GC细胞的迁移和侵袭，而miR-7表达的降低显著增强了细胞迁移和侵袭。体内转移测定还证明miR-7的过表达显著抑制GC转移。胰岛素样生长因子-1受体(IGF1R)癌基因经常在人类癌症中突变或扩增并且作为细胞生长和肿瘤侵袭的重要调节剂，被鉴定为miR-7的直接靶标。使用小干扰RNA(siRNA)沉默IGF1R与miR-7的抑制肿瘤细胞转移具有一致功能，而恢复IGF1R表达减弱了miR-7在GC细胞中的功能。该研究发现miR-7通过靶向IGF1R抑制Snail，上调E-钙粘蛋白的表达部分逆转上皮—间质转化(EMT)。 并且，对GC中miR-7和IGF1R水平的分析揭示miR-7与IGF1R表达呈负相关。该研究提供了miR-7在EMT和肿瘤转移中特定生物学行为的见解。靶向这种新型miR-7/IGF1R/Snail轴可能是阻断GC转移的一种有效治疗方法[8]。miR-200b通过促进E-cadherin的转录抑制因子ZEB2表达来抑制GC细胞中的EMT。而miR-204的下调通过激活SIRT1-LKB1途径促进EMT和GC细胞的侵袭[9-10]。以上相关文献表明miRNA对EMT的作用也是其参与调控胃癌迁移、侵袭和转移的一种作用方式。

2 miRNA与胃癌的诊断标记物

胃癌早期检测的诊断方法有限，尚没有有效的筛查方案。大多数患者在就诊时被诊断为晚期。因此，迫切需要寻找新的，特别是非侵入性的生物标志物以早期检测GC。虽然miRNA的生物学功能尚未完全了解，但miRNA相关分析表明，与正常组织相比，多种肿瘤类型显示出显著不同的表达谱[11]。正如前面所述，miRNA参与调节不同的细胞途径，例如细胞增殖、凋亡和迁移侵袭。miRNA参与肿瘤的发生，其表达在肿瘤的不同阶段有所不同[12]。当身体组织中发生恶性肿瘤时，miRNA在不同肿瘤中的表达以及疾病的不同阶段将会增加或减少。此外，miRNA是小的、内源的、单链的、非编码RNA，其长度为17～25个核苷酸。其在新鲜制备的肿瘤组织，石蜡包埋组织和外周血中具有良好的稳定性。它们的稳定性和易于测试的长度使miRNA非常适合用作生物标记物。因此，miRNA作为高度组织特异性生物标记物被用于开发各种诊断测试。然而，目前尚不清楚哪种miRNA组合对于检测早期GC最可靠，需要进一步更大规模的前瞻性研究。

3 miRNA与胃癌的预后

胃癌的预后主要取决于复发和转移的可能性,大量研究表明，某些miRNA的表达水平可用于判断胃癌的预后。有文献报道在之前的研究中发现血浆和肿瘤组织中表达下调的4种miRNA(miR-26a、miR-142-3p、miR-148a和miR-195)被证实是有希望的非侵入性的胃癌诊断生物标志物。随后研究者通过使用定量逆转录聚合酶链反应来检测石蜡包埋的GC患者手术标本中4种miRNA的表达水平，应用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验来预测miRNA与GC患者的累积总生存期(OS)之间的相关性。将石蜡包埋组织中miRNA表达的中位数用作截止值，以将患者分类为高表达组或低表达组。结果显示miR-26a和miR-148a的下调与测试组中的GC患者的较短OS显著相关。使用Cox回归分析显示miR-26a和miR-148a都是预测GC患者OS的独立预后因素。这些发现支持miR-26a和miR-148a可作为GC的潜在预后生物标志物[13]。在肿瘤或血浆中miR-200c表达与临床特征之间未发现显著相关性，多变量分析证实，胃癌组织和血浆中miR-200c的过度表达与更长的无进展存活和总体存活相关[14]。此外，miR-335的表达也与组织学类型、肿瘤分期、病理性肿瘤和淋巴结转移(pTNM)分期相关[15]。miRNA的表达与胃癌进展和转移之间的联系表明miRNA可用作预后监测工具。

4 miRNA在胃癌治疗的应用前景

目前已有一些对miRNA作为抗癌疗法的分子机制的研究。一系列实验数据表明miR-148a-3p在抗顺铂(CDDP)的胃癌细胞系中下调，过表达miR-148a-3p可通过促进线粒体分裂和降低AKAP1表达水平，使CDDP抗性细胞对CDDP敏感，其中AKAP1通过抑制P53介导的DRP1去磷酸化在CDDP抗性中发挥作用[16]。miR-508-5p的潜在抗癌特性已被证明,其作用机制为其可靶向ABCB1和含锌带结构域1(ZNRD1)的3’-非翻译区，从而使癌细胞对一系列已知的化疗剂敏感[17]。此外，在细胞减灭术和腹腔热灌注化疗后的胃癌患者，检测其治疗前后的血清，可见具有明显上调表达的microRNA，包括miR-218、miR-376a等19种microRNA，其中热疗通过上调miR-218抑制胃癌细胞迁移及提高胃癌细胞对顺铂的敏感性已有相关实验验证[18-19]。总的来说，这些数据表明miRNA不仅可作为抗癌治疗方法的靶点，还可提高化疗、热疗等治疗的敏感性，可作为耐药性和治疗反应的预测标志物。

5 展望

以上研究表明，胃癌相关性miRNA与肿瘤发生、肿瘤增殖和转移相关。虽然在miRNA可作为常规临床试验中的非侵入性筛查工具之前需要进行大规模验证的进一步研究，但将其纳入生物标志物的开发应用将增强胃癌诊断和预后检测的灵敏度和特异性。且作为胃癌的治疗靶点，通过使用有效的基因敲除、反义核苷酸和miRNA修饰来调节miRNA的表达，使它可能是一种有前途的抗癌疗法之一。总之，近年来，胃癌与miRNA之间关系的研究取得了很大的进展，为临床诊断和治疗提供了一些新的方法，并对特定人群的发病风险和治疗反应有一定的预测价值，有助于胃癌的预后评估和预防。