长链非编码RNA在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用△

王中原 孙劲禹 谢田华 殷丽 姚勇

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病常见的眼部并发症，是导致成年人失明的重要原因[1]。DR的发展伴随血管渗漏、黄斑水肿以及新生血管形成等病理过程。目前DR发病机制有诸多学说，包括多元醇通路激活、糖基化终末产物过量生成、氧化应激、蛋白激酶C活化和生长因子表达增加等[2]。这些机制共同导致DR患者视网膜微血管病变以及视网膜神经细胞的功能障碍和退化。但目前人们对DR的发病机制仍未完全明确，临床上对DR尚不能有效地预防和治疗。

长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类核苷酸数大于200且不编码蛋白质的RNA，是基因表达的重要调控因子，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。根据其基因组位置，lncRNA可分为5种类型：基因间区lncRNA、增强子lncRNA、内含子lncRNA、天然反义转录本(natural antisense transcripts,NATs)和假基因[3]。研究显示，DR发生中存在大量异常表达的lncRNA，涉及轴突引导、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、趋化因子信号通路、丙酮酸代谢等多个通路[4]。这些信号通路与神经退行性病变、新生血管形成异常、炎症等病理过程相关，提示lncRNA在DR的发生发展中发挥重要作用。本文将对目前DR相关lncRNA的基因组起源以及其在DR发生发展中的分子机制及调控作用进行综述。

1 lncRNA调控细胞凋亡

DR以血管病变和黄斑水肿为特征，伴有血管和神经元的变性，这种变性往往伴随细胞凋亡。Müller细胞作为视网膜中主要的胶质细胞，为视网膜神经元提供能量代谢所需的结构支持和能量，在视网膜神经元的生长、损伤、修复和再生中发挥关键作用[5]。lncRNA心肌梗死相关转录本(myocardial infarction associated transcript,MIAT)主要在心脏和脑组织中表达，lncRNA MIAT异常表达参与心肌梗死、微血管功能障碍、糖尿病等多种疾病的细胞增殖、凋亡和迁移[6-8]。研究发现，在糖尿病鼠模型中Müller细胞内MIAT表达增加，并与核因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)的激活密切相关。MIAT能够结合并直接抑制miR-29b，间接促进下游蛋白Sp1的表达增加，进而调控Müller细胞的凋亡[9]。此外Yan等[7]研究发现，高糖能够增加活化caspase-3蛋白水平，并且下调磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)水平。敲除MIAT能够部分逆转下调的磷酸化Akt，并且下调caspase-3的增高幅度,发挥减少视网膜细胞凋亡的作用。

核旁组织转录本1 (nuclear paraspeckle assembly transcript 1,NEAT1 )是一种定位于核旁核颗粒的新型lncRNA，能够维持核旁核颗粒的空间结构，在肺癌、食管癌和胃癌等恶性肿瘤中表达上调[10-12]。miR-497是NEAT1的潜在靶点，其3’-UTR区存在脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor anti-sense,BDNF)结合位点。BDNF在维持视网膜神经元功能和再生方面具有重要作用，来自Müller细胞的BDNF可以保护光感受器和神经节神经元，是预防糖尿病视网膜神经变性的关键[13]。实验显示，糖尿病大鼠视网膜中NEAT1明显下调，而miR-497在糖尿病大鼠视网膜和高糖刺激的Müller细胞中显著升高。综上所述，下调的NEAT1通过负调控上调miR-497，降低BDNF的表达，从而促进Müller细胞凋亡，加重DR[14]。

BDNF反义长链非编码RNA (brain derived neurotrophic factor-antisense long non-coding RNA,BDNF-AS)是近年来发现的天然反义lncRNA，在多种人体组织中自然表达，通过改变BDNF位点的染色质结构抑制BDNF RNA转录[15]。研究发现，高糖诱导视网膜色素上皮细胞凋亡，并观察到BDNF-AS的上调以及BDNF下调。靶向BDNF-AS的小干扰RNA可以改善视网膜色素上皮细胞的凋亡，并恢复BDNF的表达水平[16]。因此，BDNF-AS通过对BDNF的反向调控诱导视网膜色素上皮细胞凋亡。

2 lncRNA调控血管内皮细胞增殖

血管内皮细胞是高血糖损害的主要靶细胞，在糖尿病中发生通透性增加、重塑和表型改变等变化。DR中血管生成涉及多种血管活性因子，其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)信号是主要的限速步骤。然而，VEGF的产生可能在转录和转录后水平受到调控[17-18]。

在细胞周期激酶抑制因子4(inhibitor of cyclin-dependent kinase 4,INK4)基因座中，反义非编码RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)定位于9q21染色体上。lncRNA ANRIL可能具有直接的转录效应或间接的作用，如招募染色质重塑复合物多梳抑制复合物2 (polycomb inhibitor complex 2,PRC2)到特定的基因组位点，实验证明过表达ANRIL也可以调节组蛋白乙酰化因子p300[19-20]。PRC2以及其对组蛋白3上27位赖氨酸的甲基化在正常发育和恶性肿瘤的表观遗传学调控中发挥着至关重要的作用。PRC2复合物有4个核心亚基：EZH2 (enhancer of zeste homolog 2)、SUZ12(suppressor of zeste 12 homologue)、EED (embryonic ectoderm development)和RbBP4/7(retinoblastoma-binding protein 4 and 7)，其中EZH1/2具有甲基转移酶活性并受到SUZ12和EED调节[21]。实验表明，高糖刺激的内皮细胞中ANRIL、ANRIL-P300和PRC2表达均显著上调，ANRIL敲除可以逆转相关上调蛋白[22]。并有研究报道，DR中miR200b直接或在p300和(或)PRC2复合物调控下调节VEGF的产生[23]。综上所述，ANRIL与p300、EZH2直接结合，间接调控miR200b来增加VGFR表达水平，促进内皮细胞增殖。

视网膜非编码RNA3 (retinal non-coding RNA3,RNCR3)又称LINC00599，是一种基因间非编码RNA，Petri等[24]首次报道lncRNA RNCR3在小鼠视网膜发育过程中动态的表达，具有潜在调控神经元和少突胶质细胞分化的功能。Krüppel样转录因子2(krüppel-like transcription factor 2,KLF2) 具有调节血管张力、血管形成、维持血管稳态的作用。有研究表明，RNCR3作为一种竞争性内源RNA发挥作用，并与KLF2和miR-185-5p形成反馈回路，调节动脉粥样硬化中的血管生成障碍[25]。研究者首先在高糖刺激的视网膜内皮细胞中同时观察到RNCR3和KLF2的表达增加。实验进一步发现注射miR-185-5p类似物可以降低内皮细胞中RNCR3和KLF2的表达水平，并抑制内皮细胞增殖，而敲除RNCR3可减轻视网膜血管功能障碍。因此推断，RNCR3通过RNCR3/KLF2/miR-185-5p调控网络调节视网膜内皮细胞增殖[26]。Yan等[7]发现，MIAT也可作为竞争性内源RNA，与VEGF和miR-150-5p形成反馈回路，调节内皮细胞增殖。

长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)最先在肺癌的转移中报道[27]。有研究报道，内皮细胞缺氧可增强lncRNA MALAT1的表达，促进内皮细胞的增殖反应，基因敲除或药理抑制可降低体内血管生长[28]。在链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱导的糖尿病大鼠中，MALAT1表达显著上调，而MALAT1的下调可以显著改善周细胞丢失、毛细血管变性、微血管渗漏和视网膜炎症等现象。MAPK信号通路常被许多细胞外刺激激活，包括高糖应激。MAPK活化具有凋亡、细胞增殖、有丝分裂和多种基因转录等生理效应。视网膜内皮细胞中MALAT1的下调可以显著改变磷酸化p38-MAPK的水平，p38-MAPK通路抑制剂可以阻断MALAT1诱导的视网膜内皮细胞增殖。Liu等[29]研究表明，MALAT1通过p38-MAPK信号通路调节视网膜内皮细胞的过度增殖。lncRNA HOXA末端转录本(lncRNA HOXA transcript at the distal tip,HOTTIP)是一种从HOXA家族转录而来的非编码RNA，在糖尿病大鼠和小鼠的视网膜中观察到HOTTIP显著上调[30]。下调HOTTIP导致p38-MAPK通路失活，并减少糖尿病引起的视网膜细胞视觉功能下降和凋亡。综上所述，HOTTIP也能通过p38-MAPK通路促进糖尿病视网膜微血管病变。

FOXF1邻近非编码发育调控RNA(FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA,FENDRR)位于染色体3q13.31上，是一种长达3099 bp的新型lncRNA。FENDRR从叉头盒转录因子F1(forkhead box transcription factor F1,FOXF1)的启动子中分离转录，并与FOXF1共表达[31]。有研究报道，过表达FENDRR能够上调FOXF1的表达，反之亦然[32]。内皮基因是血管内皮生长因子信号转导的关键基因，FOXF1通过调控内皮基因参与胚胎血管的形成[33]。有研究发现，DR患者血浆中FENDRR和VEGF表达均升高，并且FENDRR过表达可显著促进VEGF表达升高，高糖诱导的视网膜内皮细胞增殖、迁移、毛细血管形态发生改变，FENDRR基因的敲除后则产生了相反的效果[34]。综上所述，lncRNA FENDRR通过与FOXF1共表达调控VEGF表达水平促进高糖诱导的视网膜内皮细胞增殖和血管生成。

lncRNA母系表达基因3(maternally expressed gene 3,MEG3)是位于染色体14q32.3，DLK1-MEG3印迹位点的非编码转录本。研究发现，相对于健康人，DR患者血清lncRNA MEG3水平显著降低,而血清VEGF和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)水平明显升高。在高糖诱导的视网膜内皮细胞株中过表达MEG3能够抑制TGF-β1和VEGF表达的增加。因此，推断MEG3也参与到TGF-β1/VEGF调控视网膜内皮细胞增殖的网络中[35]。

3 lncRNA参与炎症反应

炎症是机体防御的先天免疫系统，免疫系统通过与特定受体结合来识别外来病原体或抗原，导致细胞因子的激活并诱导促炎介质的产生。视网膜血管炎症反应可由多种因素引起，如高血糖、生长因子、糖基化终末产物、循环或玻璃体细胞因子以及趋化因子水平升高等。在DR患者的眼部微环境中，促炎分子的过表达以及持续性炎症是DR启动和进展的关键[36]。

lncRNA沉默信息调节剂1 (silent information regulatory 1,SIRT1)被报道与细胞凋亡和炎症相关，并由miR-34a调控，而lncRNA SIRT1可以通过细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和NF-κB通路抑制炎症和凋亡[37-38]。实验显示，高糖抑制MEG3和SIRT1表达，增强miR-34a表达[39]。MEG3过表达能够下调miR-34a，间接促进SIRT1蛋白表达水平增加同时抑制高糖诱导的白细胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α,TNF-α)等炎性因子分泌。实验发现，高糖能够促进IκB和NF-κB形成异二聚体，并且miR-34a类似物能够提高这种效应。但MEG3的过表达或miR-34a的下调能通过上调SIRT1部分逆转这种表达模式。综上所述，MEG3可以通过靶向miR-34a / SIRT1轴抑制NF-κB信号通路，进而减轻高糖诱导的炎症反应。

小胶质细胞是视网膜中主要的先天免疫细胞，能够调节炎症过程。研究发现，敲除MALAT1能够通过p38/MAPK信号通路阻止视网膜内皮细胞的过度增殖，改善视网膜炎症[29]。Amadori 糖化白蛋白(amadoriglycated albumin,AGA)是循环糖化白蛋白的主要形式。研究发现，lncRNA MALAT1在DR患者的纤维血管膜中显著上调，诱导了DR的微血管紊乱[4]。实验发现，注射MALAT1 shRNA能够下调MALAT1，并抑制糖尿病大鼠视网膜单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的释放。AGA处理后视网膜小胶质细胞释放MCP-1呈剂量依赖性和时间依赖性，并且AGA处理的视网膜小胶质细胞中lncRNA MALAT1的表达水平也持续升高。转染MALAT1 siRNA后，AGA诱发的MCP-1释放增加被显著抑制。综上所述，AGA能够通过MALAT1诱发小胶质细胞释放趋化因子MCP-1[40]。已有研究报道，AGA通过miR-124诱导小胶质细胞活化和炎症反应[41]，而StarBase v2.0软件预测发现MALAT1可以与miR-124形成碱基互补配对[42]。因此，推断MALAT1可能发挥竞争性RNA的作用。已有实验表明，大鼠视网膜神经节细胞中，miR-124通过直接结合MCP-1的3’-UTR控制MCP-1的表达[43]。而在小胶质细胞中，荧光素酶报告基因检测实验表明miR-124也能直接靶向MCP-1。进一步的生物信息学分析和荧光素酶报告分析证实MALAT1能够直接结合miR-124，在MALAT1 shRNA存在的情况下，糖尿病大鼠视网膜裂解液中miR-124水平升高。这些数据提示，MALAT1作为竞争性RNA负性调节miR-124的表达。最后蛋白印迹实验表明MALAT1敲除后，AGA处理的视网膜小胶质细胞MCP-1水平显著降低，但反义miR-124(anti-miR-124)能够逆转这种现象。综上所述，MALAT1/miR-124/MCP-1信号通路可能参与AGA诱导的小胶质细胞MCP-1表达。

巨噬细胞能够持续TGF-β1促进炎症反应的发展。在DR患者的房水中已检测到TGF-β1的高表达，而TGF-β信号的激活介导的炎症反应能够促进糖尿病性视网膜病变的发展[44-45]。研究表明，在DR患者血浆以及视网膜内皮细胞中MIAT的表达增高，皮尔森相关系数分析表明血浆中上升的MIAT和TGF-β1与DR存在显著的相关性，但是在未发生DR的糖尿病患者中未发现MIAT和TGF-β1的关联[46]。进一步在人视网膜内皮细胞中过表达MIAT，能够显著上调TGF-β1的蛋白表达水平。综上所述，lncRNA-MIAT可能通过活化TGF-β信号通路促进DR的发展。

4 lncRNA参与间充质转化

上皮细胞膜表型向间充质细胞表型转换称为上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。EMT分为3型: 1型EMT发生在胚胎和发育阶段，2型和3型EMT在出生后仍然活跃，参与慢性炎症和恶性肿瘤的纤维化。间充质转化(endothelial to mesenchymal transition,EndMT)被认为是EMT的一个子类，也表现为内皮细胞标志物和功能表达降低，同时间充质标志物和功能表达增加[47]。在高糖环境中，内皮细胞经历一系列的细胞内事件促进EndMT的发生。受损的内皮细胞表达肌成纤维细胞分化特征的标志物，例如α-平滑肌肌动蛋白和平滑肌22α蛋白，从而转变为间充质表型，同时内皮细胞标志物如钙黏蛋白和CD31则表达减少。与EMT类似，TGF-β超家族通过活化Smad、MEK、PI3K、p38、MAPK等下游信号分子调控EndMT[48]。H19基因是父系印迹，产生一个2.3 kb的lncRNA H19。lncRNA H19主要定位于细胞质，由位于同一位点的母系印迹基因胰岛素样生长因子2调控[49]。实验表明，高糖诱导的视网膜内皮细胞中H19表达降低，伴随着内皮标记物的显著下调，间充质标记物的上调。在高糖环境下，H19过表达能够逆转EndMT，并且还能增加葡萄糖诱导的视网膜内皮细胞中miR-200b下调。病理情况下miR-200b能够介导EndMT[50]，然而过表达miR-200b对H19的水平没有影响。糖尿病鼠和H19基因敲除小鼠在不使用胰岛素的情况下进行长达2个月的喂养，发现内皮细胞表型减少，间充质表型增加，并且血管渗漏也更加严重。高糖刺激能够使视网膜内皮细胞中TGF-β1表达增加，但过表达H19后这种现象被明显抑制。有趣的是，在使用了miR-200b抑制剂后，TGF-β1的表达量依然因为过表达H19而降低，这表明H19能够以不依赖miR-200b的方式调控TGF-β1。液相芯片分析内皮细胞溶解物相对量化的磷酸化和总TGF-β信号蛋白时发现，表达的或磷酸化的TGF-βRII、smad2、smad3、smad4、p-Akt和p-ERK1/2蛋白增加。过表达H19发现，蛋白smad2、smad3、smad4和p-Akt的表达量都没有变化，但TGF-βRII和p-ERK1/2的表达水平都降低，蛋白印迹法也显示同样的结果。因此，H19通过调控TGF-β2/MAPK/(ERK1/2)信号通路抑制高糖介导的EndMT[47]。同时有研究证实，H19也可以通过增加上游组蛋白乙酰化来改变miR200通路逆转EMT[51]。综上所述，H19可通过多种途径影响视网膜内皮细胞的间充质转化。

5 展望

尽管报道的数量有限，但是在分子生物学领域，对于阐明lncRNA调控DR发生发展的信号网络已经取得了重大突破。这些与DR发病机制相关的特异性lncRNA可能作为诊断DR潜在的生物标志物和治疗靶点。例如，根据小RNA分子特异性结合互补序列的特性，利用RNA干扰技术可以抑制lncRNA靶点的表达。动物实验已证实，基于siRNA的治疗方法可以抑制癌症和其他疾病的基因表达，且没有显著的毒性，目前正在进行临床试验[52]。但此疗法也存在lncRNA空间结构复杂，siRNAs目标亲和力低，不稳定等缺陷。

因为lncRNA在疾病发病机制中的特殊作用，lncRNA也可以作为疾病状态的标志物，辅助疾病的诊断。例如血浆lncRNA-MIAT水平可以作为DR诊断的生物标志物，ROC曲线分析表明以健康对照组为参照，曲线下面积为0.8896，95%可信区间为 0.829 7～0.949 5[46]。但目前此类方向的研究报道不多，联合运用多种高特异性的lncRNA作为生物标记物能够提高DR预测，诊断以及预后的灵敏度和特异度。

此外，lncRNA和miRNA都在DR的发病机制中起关键作用，但是DR中lncRNA和miRNA之间的相互作用仍不太清楚，尤其是lncRNA作为竞争性RNA结合miRNA调控靶基因表达的分子机制。已有研究构建出DR中竞争性的内源性RNA网络[53]，相信攻克这一难关对完全了解DR的发病机制会有重大意义。