缺血再灌注急性肾损伤机制研究进展

李爽，包宇实

(哈尔滨医科大学附属第一医院肾内科，哈尔滨 150001)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是由各种原因引起的短时间内肾功能快速降低而出现的临床综合征，表现为肾小球滤过率降低，肌酐、尿素氮潴留，水电解质和酸碱平衡紊乱。严重的AKI可导致多器官功能障碍综合征。近年来，突发性肾脏损伤伴脓毒症和多器官功能障碍综合征的病例逐渐增加，全球每年约有200万人死于AKI，存活患者中部分可能发展为不同程度的慢性肾脏病[1]。鉴于AKI的高发病率和高病死率，国际急救医学界及肾脏病学界提出了AKI的概念，期望尽量在病程早期，甚至在肾脏出现损伤而肾小球滤过率尚处于正常阶段就能将其识别，并早期实施干预，提高患者的生存率。改善全球肾脏病预后组织指南将AKI定义为：48 h内血清肌酐增高≥26.5 μmol/L；明确或经推断在7 d内血清肌酐增至≥1.5倍基础值；或持续6 h尿量<0.5 mL/(kg·h)[2]。目前，对于AKI尚无有效地减轻肾组织损伤和促进肾组织修复的治疗措施。缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是临床AKI的重要发病原因，现就缺血再灌注AKI发病机制的研究进展予以综述。

1 缺血再灌注AKI

IRI是一种病理状态，其特征是最初限制器官的血液供应，随后恢复灌注并伴随再氧化，加重组织损伤。IRI是临床导致AKI的最主要原因，肾脏缺血阶段为肾脏损害的始动环节，肾脏微血管改变，伴随缺血导致线粒体代谢障碍，细胞坏死；肾脏再灌注阶段活性氧类的产生、细胞内钙超载等变化更进一步加重了肾损伤[3]。

1.1肾脏微循环损伤 肾脏微血管系统参与肾小球滤过、肾小管重吸收，微血管系统的功能障碍和结构变化诱导肾损伤[4]。AKI血流动力学方面的肾脏微血管改变被公认为在AKI的病理生理学中起关键作用，微循环受损导致局部一氧化氮、活性氧类和氧气供需失衡，受损伤的内皮细胞激活并表达新的细胞表面标志物，促进白细胞和血小板的募集和黏附，内皮细胞损伤和炎症反应加重，继而血管通透性增加，间质水肿加重，血管内血流进一步减少；与此同时，氧化应激和血管收缩以及前列腺素等物质的释放，会加重血流缓慢甚至导致局部血液不流动的现象，闭塞的微血管系统加剧了肾脏损伤。活体显微镜下观察显示，IRI大鼠皮质管周毛细血管中的血流变得迟缓，恢复灌注后，管周毛细血管密度降低，可见，IRI所致微血管损伤的主要后果是管周毛细血管减少，加剧了肾脏持续性进行性的缺氧和肾纤维化的发展[5]。肾脏微血管靶向治疗研究证实，敲除基质金属蛋白酶2特异性基因或用基质金属蛋白酶抑制剂改善缺血性AKI动物模型的微血管通透性[6]，或通过血管内皮生长因子给药促进微血管内皮细胞的修复和增殖，均可改善肾脏损伤[7]。

1.2氧自由基、钙超载和内质网应激的作用 氧自由基是具有高生物活性的氧分子，缺血再灌注AKI伴随大量氧自由基的产生，加重肾损伤。缺氧时，ATP被快速降解为ADP和AMP，AMP进一步代谢为腺嘌呤核苷酸和次黄嘌呤，再灌注后缺氧细胞重新获氧，缺氧过程大量积累的次黄嘌呤以分子氧作为电子受体反应后产生大量氧自由基；另外，缺氧条件下，Na+-Ca2+交换机制被激活，Ca2+大量内流，同时伴随ATP供给不足，Ca2+回收障碍，致细胞内钙超载，造成膜磷脂水解，引起细胞的急慢性损伤和死亡；Ca2+浓度升高，进入线粒体的超氧化物歧化酶减少，从而使氧自由基的清除减少，钙超载与氧自由基相互影响导致肾脏缺血再灌注损伤加重[3]。

内质网负责正确的合成、组装、修饰机体内的蛋白质。IRI后，细胞内Ca2+水平和氧化还原平衡改变触发内质网应激反应，从而促进蛋白质正确折叠，促进细胞功能的恢复[8]。内质网应激包括3条未折叠蛋白反应，在IRI模型小鼠肾脏中，葡萄糖调节蛋白78和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)的表达均增加，说明IRI通过介导CHOP基因的表达，激活内质网应激反应[9]。CHOP基因缺失可以抑制IRI炎症反应，有效减轻肾损伤，而敲除CHOP基因可减少IRI小鼠肾小管上皮细胞凋亡[10]。因此，针对内质网应激未折叠蛋白反应可能是预防或治疗AKI的新方向。

2 炎症反应与缺血再灌注AKI

炎症反应是IRI后导致肾脏损伤的重要原因，炎症反应损伤血管内皮细胞和肾小管上皮细胞从而导致肾脏组织损伤，肾功能降低。IRI时炎症细胞浸润肾脏实质，并分泌相应的炎症因子，导致肾血管内皮细胞表达黏附分子和血管通透性增加，肾小管上皮细胞上调Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)增加补体结合，导致肾实质细胞损伤，肾功能急剧降低[11-12]。

2.1肾血管内皮细胞损伤 肾血管内皮细胞损伤是IRI的早期事件之一。先天免疫反应和后天性炎症级联反应作为缺血性AKI的发病机制是由内皮细胞损伤、激活以及与白细胞黏附分子的相互作用引发。研究证实，IRI后细胞内黏附分子1表达增加，中性粒细胞通过内皮趋化因子和黏附分子被吸引到肾脏炎症部位，同时黏附到内皮细胞，导致活性氧类、蛋白酶、弹性蛋白酶、髓过氧化物酶释放，加重IRI后的肾脏损伤[13]。此外，急性IRI小鼠肾脏内皮细胞趋化因子表达上调，促进巨噬细胞在肾脏组织中聚集，其中M1巨噬细胞参与损伤相关分子模式和病原体相关分子模式的激活，同时释放趋化因子、促炎症细胞因子和诱导型一氧化氮合酶，形成细胞毒性过氧亚硝酸盐，在AKI期间加重肾脏炎症损伤[14]。内皮细胞在AKI炎症反应早期通过促进白细胞的黏附趋化来增加肾脏损害。

2.2肾小管上皮细胞损伤 IRI后，近端肾小管上皮细胞基底外侧膜上的补体调节蛋白表达增加，调节 C3在管状上皮细胞的沉积；另外，IRI后肾小管上皮细胞产生促炎趋化因子、巨噬细胞炎症因子-2和角质形成细胞衍生的趋化因子等，激活调节性T细胞的表达和分泌，趋化中性粒细胞和巨噬细胞，激活补体替代途径[15]。此外，上皮细胞和管周毛细血管之间有大量的树突状细胞，树突状细胞可释放促炎细胞因子/趋化因子，介导CD1d分子激活恒定的自然杀伤T细胞与脂多糖类的抗原起反应，并与自然杀伤T细胞相互作用，激活天然免疫系统[16]。此外，树突状细胞和自然杀伤T细胞可结合CD40/CD40L诱导产生白细胞介素-12的强烈前向信号，促进恒定的自然杀伤T细胞触发信号转导及转录激活因子4磷酸化以及连续的γ干扰素分泌，加重炎症损伤[16]。TLRs可识别病原体相关分子模式参与炎症反应。IRI后，TLR2和TLR4通过肾小管上皮细胞内源性配体表达的上调，加重肾脏炎症损伤；而敲除小鼠TLR2/TLR4基因或TLR中心信号髓样分化因子88基因对缺血再灌注AKI起到保护作用[17]。另外，TLR9被认为与缺血性AKI的肾小管上皮细胞损伤有关，IRI可诱导TLR9内源性配体血浆线粒体DNA释放[18]，而近端肾小管细胞TLR9的缺失，可抑制核因子κB介导的促炎途径和胱天蛋白酶(caspase)-3/8介导的凋亡途径，缓解坏死、凋亡和炎症，对肾小管上皮细胞起保护作用[19]。同样，在缺血再灌注AKI模型中使用TLR9抑制剂羟氯喹，可抑制核因子κB信号转导途径和组织蛋白酶的活性，激活核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3，减轻缺血再灌注AKI[20]。这些研究突出了缺血再灌注AKI炎症反应在肾血管内皮细胞和肾小管上皮细胞损伤中的重要作用。

3 凋亡、细胞周期停滞和细胞坏死与缺血再灌注AKI

肾小管上皮细胞损伤和死亡是AKI的关键病理特征[21]。IRI通过氧化应激和炎症反应等复杂的病理生理改变，引起肾小管上皮细胞损伤，导致严重的细胞凋亡或坏死，加重肾脏损伤。

3.1凋亡、细胞周期停滞与缺血再灌注AKI 细胞凋亡是外来因素触发细胞内预存的死亡程序而引发的细胞程序性死亡。缺血再灌注AKI动物模型和人类AKI肾脏活检均显示肾小管上皮细胞发生了凋亡变化[22]。IRI后，凋亡信号分子(肿瘤坏死因子-α、Bax、caspase等)在肾小管上皮细胞高表达，体内促凋亡蛋白Bax表达上调，而抗凋亡基因Bcl-2表达下调[23]。IRI期间凋亡途径激活的机制包括外在机制和内在机制，外在机制是由肿瘤坏死因子-α和凋亡相关因子配体与相关凋亡诱导受体的结合触发，继而通过激活启动子caspase-8和caspase-10启动蛋白水解级联反应[24]；内在机制是由于线粒体外膜损伤使细胞色素C释放到细胞质中，形成多蛋白复合物(即凋亡小体)，启动caspase-9介导的蛋白水解级联反应[25]。有学者利用间充质干细胞的抗凋亡特性对缺血再灌注AKI模型小鼠进行治疗，结果发现，抗凋亡基因Bcl-2的表达升高，促凋亡基因Bax的表达下降，缺血再灌注AKI显著改善[26]。

在真核生物中，细胞周期由4个不同的阶段(G1、S、G2和M)组成。在正常肾脏中，仅有1%的肾小管上皮细胞处于增生期，而其余细胞均处于休眠期(G0期)[27]。AKI时，G0期的肾小管上皮细胞结束休眠，开始进入细胞周期的循环中，正常肾小管上皮细胞的周期启动有利于肾脏损伤的修复，损伤细胞的细胞周期停滞于G1期可以防止损伤细胞的DNA复制。细胞内的细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)可促进细胞周期的进行，而对这一过程调节的蛋白质主要有两类：一类包括p21、p27和p57蛋白家族，主要与CDK2结合并抑制其功能，阻止细胞进入G1晚期或S期；另一类蛋白家族是CDK抑制因子4家族，主要与CDK4/6结合使细胞停滞于G1期[27]。研究发现，AKI时细胞内的p21水平显著升高，同时伴有细胞周期停滞，与p21敲除的大鼠相比，IRI后的野生型大鼠肾脏p21上调，肾脏损伤更轻[28]。另外，组织金属蛋白酶抑制物2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factors binding protein 7，IGFBP7)水平在AKI肾小管上皮细胞中也升高，两者可分别诱导p27和p21的表达增加，从而阻止细胞进入下一个周期，且TIMP-2和IGFBP7是肾小管上皮细胞参与调节细胞周期的关键环节[29]。心脏手术前的缺血预处理使肾小管上皮细胞TIMP-2和IGFBP7的表达均上调，因此术后AKI出现的风险显著降低[30]。近年来，TIMP-2和IGFBP7已成为临床早期诊断AKI和预测AKI预后非常重要的生物标志物。

3.2细胞坏死与缺血再灌注AKI 长期以来，细胞坏死被认为是被动的非能量依赖性的细胞死亡，通过细胞肿胀和细胞膜破坏释放损伤相关模式分子，如高迁移率族蛋白、ATP等，随后激活炎症和免疫系统，加重组织损伤。肾小管上皮细胞坏死是缺血再灌注AKI的主要病理特征。近年研究表明，细胞坏死取决于细胞内Ca2+积累和蛋白酶活化的综合结果[31]。组织缺血缺氧时ATP不足，损伤Ca2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶，激活Na+-Ca2+交换机制，Ca2+大量内流，激活蛋白酶(如钙蛋白酶和磷脂酶)，这些酶会诱导细胞膜通透性发生改变和细胞骨架蛋白膜磷脂的水解，最终导致细胞坏死[32]。此外，针对IRI肾脏细胞坏死途径的研究发现，细胞坏死主要由细胞质受体蛋白激酶3、细胞质受体蛋白激酶1和混合谱系激酶结构域样蛋白的相互作用介导，通过敲除小鼠细胞质受体蛋白激酶3或混合谱系激酶结构域样蛋白基因，可抑制细胞坏死，减轻缺血再灌注AKI，而利用细胞质受体蛋白激酶1活性抑制剂Nec-1(necrostatin-1)预处理的小鼠，可以提高小鼠缺血后的存活率，减轻缺血再灌注AKI[33]。

4 自噬与缺血再灌注AKI

自噬是一个依赖于溶酶体的分解代谢过程，消除老化细胞器和大分子蛋白质，为细胞器的更新和细胞修复提供营养代谢支持[34]。自噬作为细胞应对生存压力的一种自适应防御，在维持细胞稳态过程中发挥关键作用[35]。在IRI过程中，近端肾小管上皮细胞中自噬体和自溶体高表达，自噬对IRI中细胞存活和细胞死亡起重要作用。

自噬的激活可以对缺血再灌注AKI的肾小管上皮细胞提供保护。研究表明，自噬的发生具有时间依赖性，而且其诱导时间早于细胞凋亡的发生，激活自噬有助于缺血再灌注AKI的保护；雷帕霉素预处理激活自噬可减轻缺血再灌注AKI，抑制细胞凋亡，改善肾功能；相反，抑制自噬可使肾小管细胞凋亡增加，肾功能恶化[34]。与野生型小鼠相比，端粒酶基因敲除损伤哺乳动物雷帕霉素靶蛋白介导的自噬信号后，IRI小鼠肾功能的恢复显著延迟[36]。缺血预适应促进自噬作用，可减轻缺血再灌注AKI，而使用氯喹和3-甲基腺嘌呤抑制自噬却加重了IRI后肾小管细胞凋亡[37]。通过削弱近端肾小管中的腺苷酸活化蛋白激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号转导通路可抑制自噬的激活，加剧缺血再灌注AKI，而激活近端肾小管细胞发生线粒体自噬，则减弱了IRI过程中的肾脏损伤[38]。另外，高压氧治疗可以通过激活细胞自噬对IRI大鼠肾脏模型起到保护作用[39]。因此，细胞自噬可以对IRI导致AKI的肾脏组织发挥有效的保护作用。

另一方面，自噬的过度激活可导致AKI加重，抑制过度自噬可以改善缺血再灌注AKI。中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白可诱导肾小管上皮细胞过度自噬，加重缺血再灌注AKI[40]。成纤维细胞生长因子-10可抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白介导的过度自噬，缓解缺血再灌注AKI大鼠模型的肾功能[41]。氯化锌可减轻内质网应激，减少自噬相关蛋白Beclin-1和溶酶体关联膜蛋白2的表达，改善缺血再灌注AKI的炎症反应[42]。此外，微RNA也可抑制自噬，减轻缺血再灌注AKI[43]。对缺血性肾纤维化小鼠模型的研究显示，自噬最初与近端肾小管的反应是适应性的，过度自噬最终会导致适应不良[44]。

因此，自噬作为一种新发现的程序性细胞死亡形式，对IRI后肾小管上皮细胞的存活和死亡具有重要意义。自噬是一把“双刃剑”，自噬的激活在缺血再灌注AKI过程的早期具有保护作用，而过度自噬激活在缺血再灌注AKI过程的晚期则可促进细胞凋亡和细胞死亡。细胞自噬的调节有望成为AKI治疗的重要干预靶点。

5 小 结

缺血再灌注AKI的机制包括经典的肾脏微血管改变以及由肾血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和白细胞(如中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞)介导的炎症反应。细胞凋亡、坏死等方面机制的研究也为缺血再灌注AKI提供了更新的潜在治疗靶点。此外，自噬是AKI新兴的研究方向，自噬对IRI后细胞存活和死亡具有重要意义。自噬的保护或损害功能取决于细胞自噬激活的时间和数量。充分理解缺血再灌注AKI的发生机制，并针对其病理生理过程进行干预，可以为AKI的临床预防和治疗提供帮助，进而降低AKI患者的肾脏损伤，提高生存率。