肠道微生态与非小细胞肺癌发生机制及治疗的研究进展

石然,何敬东

(南京医科大学附属淮安第一医院肿瘤内科，江苏 淮安 223300)

肺癌是最常见的癌症类型和癌症死亡的主要原因，同时也是最重要的可避免的死亡原因之一[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的一种最常见类型，发病隐匿，大多患者确诊时即为晚期，失去了手术治疗的机会，如何有效治疗NSCLC一直是研究的热点和难点。遗传和环境因素在癌症发展中发挥重要作用，微生物群落的参与也逐渐被认可[2]。自人体微生物组学计划提出以来，肠道微生物群在疾病与健康中的作用逐渐受到重视，成为热点话题。肠道微生物群的“系统性”影响更大，与免疫系统的联系超越了局部效应[3]。研究数据显示，肠道菌群可通过肠-脑轴、肠-肺轴、肠-肝轴、肠-骨轴等参与多种疾病的发生，对人体代谢、内分泌、免疫及周围和中枢神经系统均有很大的影响[4]。肠道和呼吸道虽然在内部环境和生理功能等方面存在差异，但具有相同的胚胎起源，在肺癌的发生、发展中可能存在相互关联[5]。现就肠道微生态与NSCLC发生的相关机制以及如何通过干预肠道微生态解决肺癌治疗过程中的一些常见问题予以综述。

1 肠道微生态与NSCLC

近年来，越来越多的研究报道肠道微生态与肺癌密切相关，而饮食因素是导致肺癌发生的危险因素之一。流行病学研究表明，有些食物(抗氧化剂、植物雌激素等)可以减少肺癌的发生，这一过程可能由肠道微生物群介导[6-7]。肠道菌群可通过对一些(如木脂素)食物的发酵作用，产生植物雌激素肠内脂，从而起到防治NSCLC的作用[8]。19世纪，有学者观察到肿瘤中存在白细胞，首次表明炎症与癌症之间可能存在联系，此后越来越多的研究对其进行了证实[9]。有研究发现，新生儿肠道中的双歧杆菌、阿克曼氏菌和粪卡利菌等细菌数量的减少与呼吸道炎症的风险增加有关[10]。预防性补充长双歧杆菌51A可保护小鼠免受卵巢切除引起的变异性气道炎症和气道高反应性加重[11]。Zhuang等[12]通过对30例肺癌患者(试验组)和30例健康人(对照组)的肠道微生态进行16S rRNA测序，发现对照组的放线菌门和双歧杆菌属水平较高，而试验组的肠球菌丰度较高，且肺癌患者肠道微生物群的正常功能降低。老年NSCLC患者的肠道微生态失调，肠球菌增多，产丁酸菌减少。研究发现，肠道菌群不仅在局部黏膜水平，也在全身水平影响炎症和免疫功能，从而起到抗肿瘤的作用[13]。肠球菌可能是NSCLC发生及进展的生物标志物，而肠道益生菌可能通过减弱呼吸道炎症反应预防NSCLC。

2 肠道微生态失衡导致NSCLC的机制

微生物群可以通过基因、蛋白质或代谢物来决定宿主的健康和疾病[14]。正常情况下，肠道微生物群与人体互惠互利，宿主基因、环境因素、饮食、疾病、医疗干预(如抗生素)以及其他一些因素影响肠道微生物群的结构，而肠道微生态紊乱会导致一系列疾病，包括肥胖、糖尿病、自身免疫性疾病、过敏、炎性肠病和癌症等[15]。肠道微生态是人体免疫系统不可缺少的重要环节。研究发现，缺乏肠道菌群的无菌小鼠具有严重的免疫缺陷，黏膜免疫层缺损[16]。除了对局部免疫反应的影响，肠道微生物群还有助于诱导机体的先天免疫和适应性免疫[17]。

2.1肠-肺轴的作用 肠道菌群失调与多种肺部疾病有关。恢复小鼠肠道中的微生物群可降低肺炎的严重程度，肠-肺轴在这一过程中发挥了重要作用[18]。“肠-肺轴”来源于“内脏淋巴”理论，该理论认为大量存在于肠黏膜下层或肠系膜淋巴结的巨噬细胞、免疫细胞以及易位细菌若未被第一道防线消灭，存活的细菌、细胞壁碎片或死细菌的蛋白质部分会随着肠道中产生的细胞因子和趋化因子逃逸，并随肠系膜淋巴系统到达乳糜池，进入肺循环，导致树突状细胞和巨噬细胞的局部活化以及T细胞的启动和分化[2]。肠-肺轴为双向轴，表现为一个细胞的免疫反应随另一个细胞的改变而改变。免疫系统的刺激不仅来源于微生物本身，也来自它们的代谢产物。刺激物可以直接或间接地通过免疫细胞影响多个器官，这种相互作用可能导致免疫增强，协助先天免疫系统的抗肿瘤反应，肠道微生物群的变化也可能会影响肺微生物群，反之亦然[3]。另有研究认为，支气管黏膜淋巴组织与胃肠道相似，其中的联系可能与肠肺的共同黏膜免疫相关，肠道微生态的变化导致下游免疫反应改变，引起肺炎症反应，而免疫系统异常也会使肠道菌群失调，影响远端黏膜的免疫反应，使肺部免疫失衡[19]。

辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)可能是肠道与肺之间沟通的主要途径。微生物感染可诱导Th17细胞分化，使白细胞介素(interleukin，IL)-17A和IL-17F产生增加，进而导致肺中性粒细胞浸润[20]。肠道菌群中的一种分节丝状细菌能通过Th17细胞诱导肺自身免疫，由于CC趋化因子配体20在肺中表达旺盛，因此分节丝状细菌诱导的肠道Th17细胞优先被招募到肺中，引起肺病变[21]。大型病例对照分析表明，使用青霉素、头孢菌素或大环内酯类等抗生素可能会增加肺癌的发生风险[22]，原因可能为：抗生素治疗消除了有效启动具有抗肿瘤特性的T淋巴细胞所需的细菌种群，同时为其他机会性病原体在肠道和肺部的定居创造了条件[4]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是一种病原模式识别受体，在特异性免疫和非特异性免疫中具有重要的连接作用。TLR4是TLR亚型之一，在淋巴细胞、单核细胞等免疫细胞中表达，可以导致炎症反应，与肿瘤的发生密切相关。Tsay等[23]对C3H/HeN小鼠和C3H/HeJ (TLR4缺陷)小鼠进行了4周的抗生素处理以消耗肠道共菌群，第3周在饮用水中添加TLR4的配体脂多糖，触发肠道TLR，第4周将大肠埃希菌注射到气管中诱导大肠埃希菌肺炎，结果发现，抗生素处理后的小鼠肺泡巨噬细胞的抑菌活性显著降低，而在抗生素预处理过程中补充脂多糖可逆转这一效应并降低大肠埃希菌肺炎小鼠的病死率。可见，肠道菌群可以通过TLR4通路促进中性粒细胞浸润，诱导小鼠肺部炎症反应。

目前肠-肺微生物群研究有两个主要的局限性：在微生物群中观察到的变化是疾病的原因还是结果目前尚不清楚；大多数实验数据均描述肠道微生物群对肺部疾病发生、发展的影响，而不是对已确定的肺部疾病的影响。肠-肺轴的研究目前尚处于起步阶段，有可能成为肺癌治疗的新方向[24]。

2.2短链脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)的作用 肠道微生物组成成分的变化与免疫反应的改变及气道的稳态有关。肠道微生物的组成成分和代谢产物SCFAs有可能成为调节免疫系统的关键介质。SCFAs可能通过直接作用于靶部位或通过肠道/循环免疫系统刺激间接介导肠道的“远距离”影响。有研究发现了SCFAs在影响骨髓造血前体中的作用，而骨髓造血前体是先天和适应性免疫细胞发育的主要部位[25]。碳水化合物(特别是膳食发酵纤维)可以通过改变微生物群和增加SCFAs增强肺的免疫功能，SCFAs通过激活其受体(如乙酸盐和丙酸盐)或抑制丁酸盐刺激调节性T细胞，从而保护气道免受炎症的影响[26]。Trompette等[27]发现，喂食高纤维食物小鼠的SCFAs循环水平升高，且对肺部的过敏性炎症有保护作用；而喂食低纤维食物小鼠的SCFAs水平降低，过敏性气道疾病增加；进一步进行机制探究发现，SCFAs可能通过改变骨髓造血功能增加巨噬细胞和树突状细胞前体的生成，使具有高吞噬能力的树突状细胞播散到肺中，减弱Th2细胞效应功能，从而保护肺免受过敏性气道炎症的影响。另外，叉头框蛋白3(forkhead box protein 3，Foxp3)可与IL-9位点结合，抑制IL-9的产生，而丁酸盐可以有效上调Foxp3的表达，负调控Th9细胞的分化和功能，在肺炎症中发挥保护作用[28]。

SCFAs在抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程中也起重要作用。Xiao等[29]采用微阵列分析NSCLC细胞系A549的微RNA(microRNA，miRNA)发现，丁酸钠处理后的A549细胞miR-3935的表达上调，而荧光素酶报告基因检测发现miR-3935过表达显著抑制了A549细胞的增殖和迁移。另外，丙酸钠治疗可导致细胞周期阻滞，尤其是G2/M期。Kim等[30]采用逆转录定量聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法检测发现，丙酸钠可以通过调控H1299和H1703肺癌细胞株Survivin和p21的表达水平，抑制肺癌细胞系的细胞增殖。

2.3肠道菌群对肺免疫系统发育的作用 肠道菌群是影响出生后免疫系统发育的重要因素。肠道共生菌的定植促进了IL-22产生ILC3s (IL-22+ILC3)优先转运到肺的能力，其机制可能是肠道共生菌群诱导了IL-22的产生和肺归巢信号CC趋化因子受体[chemokine(C-C motif) receptor，CCR]4的表达，增强了新生儿对肺炎IL-22依赖的抵抗力[31]。自然杀伤T细胞(natural killer T cell，NKT细胞)是T细胞的一个表型和功能多样化的子集，在非典型主要组织相容性复合体Ⅰ类分子CD1d的背景下识别自身和微生物脂质，并在抗菌防御、癌症免疫监测和调节免疫介导的疾病中发挥关键作用。有证据显示，黏膜微生物群与CD1d以及NKT细胞之间存在广泛的交叉调控[32-34]。黏膜表面的微生物暴露，特别在出生后早期发育期间，可以调节NKT细胞在肠道和肺部的转运及功能，并决定NKT细胞介导的炎症性疾病的易感性[34]。这些数据表明，在生命早期存在一个关键的发育窗口，在这个窗口中，胃肠道中的微生物多样性启动了对哺乳动物健康的系统免疫反应。

3 肠道微生态与NSCLC的治疗

NSCLC的治疗主要包括手术治疗、化学药物治疗、靶向治疗、免疫治疗等。由于肺癌发病的隐匿性，大多数患者确诊时已丧失了手术机会。药物治疗方案经过大样本临床试验证实可以延长患者的生存期，并使肿瘤缩小，但在治疗过程中仍存在不良反应大、疗效不佳等问题，给肺癌的治疗带来了极大的困扰。由于肠道菌群不仅影响局部黏膜水平的炎症和免疫，还影响全身系统免疫，因此提出了一个假设，即肠道菌群有助于肺癌的治疗。

3.1肠道微生态与NSCLC的靶向治疗 靶向治疗是目前治疗肺癌的重要方法，具有特异性、有效性和低毒性等优势。目前临床应用较多的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂包括吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼等，而药物相关性腹泻是治疗过程中不可忽视的严重不良反应。研究表明，厄洛替尼和吉非替尼用药后腹泻发生率为40%～60%[12]。另外，肺癌患者靶向治疗期间发生的院内感染可能与肠道菌群失调相关，患者在接受化疗、靶向治疗后益生菌和潜在致病菌均减少，益生菌/致病菌值降低；双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌定植于宿主肠道，不仅具有生物屏障及生物拮抗作用，还具有营养、免疫增强、延缓机体衰老、抑制肿瘤等功能，因而对患者实施抗生素预防可能会进一步加剧肠道菌群失调[35]。Pal等[36]对20例接受血管内皮生长因子-酪氨酸激酶抑制剂治疗的转移性肾细胞癌患者的粪便样本进行分析发现，样本中双歧杆菌含量较低，且发生腹泻的患者其肠道菌群中拟杆菌属含量较高，普雷沃氏菌属含量较低。在排除其他影响因素的条件下，纠正肠道微生态失调可能成为治疗靶向药物导致的药物相关性腹泻的重要方向。

3.2肠道微生态与NSCLC的化学疗法 化学疗法常用于术后辅助治疗或肺癌晚期患者的治疗。环磷酰胺是一种重要的抗癌免疫调节剂，可以使小鼠肠道菌群中某些革兰阴性菌向次级淋巴结转移，刺激宿主产生一群特殊的Th17细胞和Th1细胞，从而引起抗肿瘤免疫。有研究表明，海拉氏肠球菌和巴氏肠杆菌可以改善环磷酰胺的功效，肠球菌从小肠转移到继发性淋巴器官，增加肿瘤内CD8/调节性T细胞的比值，巴氏肠杆菌在结肠内逐渐积累，并促进癌变部位γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)诱导的γδT细胞的渗透；海拉氏肠球菌、巴氏肠杆菌细菌特异性记忆Th1细胞延长了接受化学免疫治疗的晚期肺癌和卵巢癌患者的无进展生存期[37]。NSCLC的一线化疗方案首选两药联合的含铂(指顺铂和卡铂)方案。顺铂与益生菌联合有助于提高顺铂的促凋亡和抗增殖作用。Gui等[38]利用Lewis肺癌小鼠模型研究肠道微生物群的抗肿瘤作用，用顺铂联合ABX方案(万古霉素、氨苄西林、新霉素的抗生素混合物)治疗破坏宿主共菌群的小鼠，结果发现，其肿瘤较单用顺铂治疗的小鼠大，且小鼠存活率显著降低，而用顺铂联合乳酸菌治疗的小鼠肿瘤小，存活率高；进一步研究表明，ABX通过上调血管内皮生长因子A的表达，下调BAX和抑癌基因P27的表达，在一定程度上损害顺铂的功能，经ABX处理的小鼠CD8+T细胞中IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素1的表达均下调，表明共生菌群具有增强免疫的作用，与乳酸菌联合治疗小鼠的IFN-γ、颗粒酶B、穿孔素1表达均增强。以上研究均说明，一些特定的肠道菌群具有增强化疗药物抗肿瘤的作用。

肺癌化疗患者常伴有严重的肠道不良反应，如化疗相关腹泻、便秘、肠道菌群破坏(乳酸菌、双歧杆菌、拟杆菌数量减少，不同致病微生物数量增加)等。研究发现，在伊立替康联合顺铂方案治疗的小细胞肺癌患者中，发生化疗相关性腹泻的患者出现了肠道菌群紊乱，致肠道菌群多样性降低[39]。Serkova等[40]以枯草芽孢杆菌为基础，在采用联合益生菌复合治疗的基础上，对肺癌化疗患者的治疗进行改进，该研究纳入30例接受化疗的肺癌患者，其中试验组患者(21例)在化疗过程中同时接受以枯草杆菌为基础的益生菌联合治疗，而对照组患者(9例)仅接受化疗制剂，结果发现，试验组治疗后消化不良的症状减轻，肠道微生物组成成分改善。因此，在肺癌患者化疗中使用益生菌可降低胃肠道疾病的发生率，防止肠道微生物群的恶化。

3.3肠道微生态与NSCLC的免疫治疗 目前肿瘤治疗的重点已从靶向肿瘤细胞转移到免疫系统，免疫治疗在肺癌中的作用日益受到重视。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors，ICIs)的出现标志着肺癌治疗已进入免疫治疗时代，肠道菌群多样性可能会影响免疫治疗的效果。Hakozaki等[41]对90例接受nivolumab治疗的NSCLC患者的资料进行回顾性分析，发现nivolumab治疗前接受抗生素治疗患者的中位无进展生存时间为1.2个月，而未接受抗生素治疗患者的中位无进展生存时间为4.4个月。Routy等[42]发现，抗生素抑制了晚期癌症患者ICIs的疗效，将对ICIs治疗有反应患者的粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)到无菌或抗生素治疗的小鼠体内，可以改善程序性细胞死亡受体1(programmed cell death receptor-1，PD-1)阻滞剂的治疗效果，而对ICIs治疗无反应患者的FMT则无这样的作用，通过给移植无反应患者FMT的小鼠喂食艾克曼菌，可以改善ICIs的抗肿瘤作用。肠道菌群对ICIs疗效增强的作用可能是通过增加CCR9+、CXCR3+、CD4+T淋巴细胞在小鼠肿瘤组织的募集实现。肠道菌群多样性与抗PD-1免疫治疗反应密切相关，良好的肠道微生物群(如高多样性)患者在周围表现出增强的记忆T细胞和自然杀伤细胞特征，肠道微生物组的高度多样性可促进Th1淋巴细胞分化及辅助/细胞毒性T细胞活化，使淋巴细胞PD-1表达上调，从而增强抗PD-1治疗的效果[43]。针对nivolumab治疗晚期NSCLC患者粪便样本的研究发现，微生物组多样性高的患者对PD-1治疗的应答较好，且无进展生存期显著延长，在抗PD-1治疗后，其周围独特的记忆CD8+T细胞和自然杀伤细胞亚群频率较高[44]。与PD-1治疗过程中使用抗生素干扰肠道菌群多样性的NSCLC患者相比，肠道菌群多样性较低的患者免疫治疗后的无病进展期和总生存期均缩短[45]。这些研究结果表明，肠道微生物群对抗PD-1免疫治疗的预测和评价具有重要意义。

粪便频率是反映肠道微生物群的一个重要指标，观察患者大便频率可能是预测NSCLC ICIs临床疗效的生物标志物以及晚期NSCLC患者的预后因素。Katayama等[46]回顾性研究了40例接受ICIs治疗的晚期NSCLC患者，并将便秘或使用泻药的患者定义为大便异常，结果发现，20例患者大便异常，另20例患者大便正常，且伴有粪便异常NSCLC患者的疾病控制率低于无粪便异常NSCLC患者；有基础便秘NSCLC患者经ICIs治疗后的总生存期显著短于无便秘NSCLC患者。另有研究发现，在首次注射抗PD-1抗体前的晚期肺癌患者的粪便样本中，无腹泻患者的拟杆菌门细菌数更高，厚壁菌门、变形菌门菌数较低[47]。

目前，利用肠道微生态干预肿瘤治疗效果的主要方法是FMT。FMT包括整体菌群移植和选择性菌群移植。FMT是指常规使用150 mL 0.9%氯化钠注射液将30 g供体新鲜粪便悬浮过滤去渣后，通过胃镜、鼻-空肠管、肠镜、造瘘口、灌肠等方法导入患者肠道中，以此改善受菌者的肠道菌群。早在我国东晋时期，《肘后备急方》中就有记载用人粪清治疗食物中毒、腹泻以及发热等症状。Gopalakrishnan等[48]检测112例接受PD-1免疫治疗的恶性黑色素瘤患者口腔和肠道微生物群，发现反应者和无反应者肠道微生态的组成存在显著差异；对患者粪便微生物组样本分析显示，对PD-L1治疗有反应患者的瘤胃菌科丰度较高，而免疫分析显示，对PD-1治疗有反应患者以及接受FMT无菌小鼠的抗肿瘤免疫均增强。另外，也有研究通过FMT确定了Bifidobacterium longum、Collinsella aerofaciens以及Enterococcus faecium等菌群对抗肿瘤免疫反应效果良好[49]。虽然目前缺乏大规模的临床试验，但通过FMT或口服相关菌群，可能会提高肺癌免疫治疗的疗效。

4 小 结

肠道微生态与NSCLC的发生、进展密切相关，干预肠道微生态可能为NSCLC的治疗提供新的方向。肠道微生态失衡会通过肠-肺轴引起肺部炎症，进而促进细胞异型增生，最终引起细胞癌变。检测肠道菌群种类及丰度可能有助于NSCLC的早期诊断，而以FMT或口服益生菌的方法可能有助于改善NSCLC的疗效。目前影响肺癌的因素众多，具体如何通过肠道菌群早期发现肺癌并提高其疗效、在肺癌患者治疗期间如何规范性使用益生菌治疗药物相关性胃肠道不良反应以及肺癌患者需要符合哪些条件才能使用FMT方法等目前尚无定论。肠道微生态疗法作为新兴的增强肺癌疗效的方法，具有广阔的应用前景，可能为肺癌患者的早期诊断及治疗带来新希望。